管碟法测定土霉素片含量的影响因素分析

黄依玲

(广西壮族自治区南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530001)

土霉素片为四环素类抗生素，目前部颁标准仍采用微生物检定法[1]测定其含量。在实际操作中发现，影响此法测定结果的因素较多，若不注意排除可导致结果偏差较大。为此，笔者对该法的部分操作环节进行探讨，分析产生误差的原因，以保证测定结果的准确性。

1 仪器与试药

ZY－300A型抑菌圈自动测量仪(北京先驱威锋技术开发公司);梅特勒－托利多AB265－S型电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司)。试验菌藤黄微球菌[CMCC(B)28 001]来源于广西食品药品检验所;菌悬液依法制备[2];培养基抗生素微生物检定培养基Ⅱ号(pH为6.5～6.6，北京山药科技开发公司，批号为080428);灭菌磷酸盐缓冲液(pH=6.0)。土霉素片(某制药有限公司，规格为每片0.25 g∶25万单位，批号为20100708);土霉素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为130305－200720)。

2 方法与结果

2.1 测定方法

按部颁标准[1]，取土霉素片10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于土霉素0.25g)，先加入0.1mol/L盐酸溶液50 mL，使土霉素溶解，再加灭菌用水至250 mL，摇匀，依法测定。

2.2 影响因素试验

2.2.1 钢管的清洁度及重量均匀度

A管，使用过的钢管灭菌后先用水洗涤，超声30 min，水冲洗，再用试验用水冲洗3遍，晾干灭菌后使用;B管，使用过的钢管灭菌后用烧开的肥皂液浸泡，趁热用小毛刷逐个刷干净、水冲洗，再用试验用水冲洗3遍，晾干灭菌后使用;C管，将B钢管进行清理、剔除有锈斑或有缺口者并逐个称量，按其重量分套，每套钢管重量差异不超过±50 mg。按部颁标准[1]要求，分别用A，B，C钢管进行试验，检验结果见表1。可见，使用C管与A管的检测结果无显著性差异(t=2.191＜2.776，P＞0.05)、与使用 B 管的检测结果也无显著性差异(t=0.611 4＜2.776，P＞0.05);但使用A管检测结果的极差为7%、可信限率为8.6% ～11.8%，使用B管检测结果的极差为3.8%、可信限率为5.4% ～7.9%，两者每组结果的可信限率均未达到标准操作规范[3]的要求(5%)。使用C管检测结果的极差为2.6%，可信限率为3.5% ～5.2%。检验结果的误差及可信限率依次为A＞B＞C。结果表明，使用C管检测结果的误差小、可信限率较理想，可达到标准操作规范[3]的要求。

表1 钢管的清洁度及重量均匀度影响因素测定结果[含量(%)]

2.2.2 制样方法

按部颁标准[1]操作，使用C钢管，分别按下述方法试验，检测结果见表2。方法一，精密称取样品，置乳钵中，先加入少量0.1 mol/L盐酸溶液研磨，再用剩余0.1 mol/L盐酸溶液将样品分次转入250 mL容量瓶中，超声约30 min，再加灭菌用水至刻度，摇匀;方法二，精密称取样品，置250 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液50 mL，直接超声约30 min，再加灭菌用水至刻度，摇匀。结果表明，两种制样方法的检测结果无显著性差异(t=0.064 ＜2.776，P＞ 0.05)。

表2 制样方法影响因素试验结果[含量(%)]

2.2.3 抑菌圈摆放角度和位置

对同一区组平皿的抑菌圈扫描，抑菌圈摆放的位置不同，两个低剂量(S1，T1)抑菌圈几乎在同一水平，或S1高于T1的角度约为 15 ～ 20°，45°，65°时，所测得结果有较大差异。结果见表3。抑菌圈摆放的位置不同，结果极差为7%;当S1圈高T1圈的角度达到或大于45°时，结果明显偏低。

表3 抑菌圈摆放位置影响因素试验结果[含量(%)]

3 讨论

使用过的钢管容易残留试验中的抗生素，应将灭菌后的钢管用烧开的肥皂液浸泡，趁热用小毛刷逐个刷干净后用水冲洗，再用试验用水冲洗3遍，确保清除吸附于钢管的残留物。钢管久用易发灰、发暗，出现锈蚀或有缺口，应及时清理剔除，将仍能用的逐个称量，按其重量分套(每套钢圈重量差异不超过±50 mg)使用。本试验所用的抑菌圈自动测量仪每年或半年均定期进行图像、同一抑菌圈在不同位置测量、回收率试验误差、重复测量的精密度等指标考察(试验用菌为短小芽孢杆菌，对照品为红霉素或硫酸庆大霉素)。本试验是在上述各项考察指标均达到检定规程要求下进行的，之所以出现扫描时抑菌圈摆放的位置不同，所测得结果有较大差异，有可能是与仪器本身扫描的角度有关，或与所用试验菌不同有关。建议在用藤黄微球菌进行土霉素效价测定时，应注意抑菌圈摆放的位置，S1圈高T1圈的角度约20°即可，不应过大。抑菌圈自动测量仪应定期进行检定，符合要求才使用。

[1]WS1－C2－0002－89，卫生部药品标准·抗生素药品(第一册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录93－附录98.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2010:286－295.