体腔积液薄层液基细胞涂片免疫组化染色方法研究

王兴波 王 静 冯冬青 万晓书 王东梅

1.河北省秦皇岛市第二医院，河北秦皇岛 066000；2.河北省秦皇岛市昌黎县妇幼保健院，河北昌黎 066600；3.河北省秦皇岛市妇幼保健院，河北秦皇岛 066000

薄层液基细胞技术（thin-layer cytology test，TCT）是20世纪90年代兴起的一项新技术，最早应用于妇科宫颈细胞学检查，并获得了良好的效果[1]。随后人们不断将此项技术应用到非妇科细胞学检查[2-4]，并与传统脱落细胞学涂片比较，具有薄层、背景清晰、面积小、血液成分少、利于显微镜观察等优点，但在癌性体腔积液TCT检查中存在癌细胞比较散在或细胞团不如传统涂片立体感强等不足。经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色癌细胞与间皮细胞的鉴别有时很困难，对癌细胞来源及分类更一筹莫展。体腔积液多数混有间皮细胞，常常需要免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色与癌细胞加于鉴别，并对癌细胞进行分类。IHC染色如果不先经HE染色，则不清楚TCT涂片中是否存在癌细胞或可疑癌细胞（目标细胞）或者TCT涂片是否合格，如果经HE染色而采取不同退色方法，会造成不同结果。有报道使用盐酸、高锰酸钾及草酸等对传统涂片和组织切片HE染色进行退色[5-6]。笔者曾在组织切片上采用抗原热修复方法退色，效果较好[7]。胸水TCT涂片IHC染色，由于每张TCT涂片中的细胞排列是随机的，常规IHC染色针对性较差，往往造成诊断困难，为了准确鉴别间皮细胞与癌细胞以及对癌细胞进行详细分类从而达到确诊目的，本小组采用双重免疫组化（double immunohistochemistry，DIHC）染色，即在一张 TCT涂片上，同时显示两种抗原成分[8]，来弥补一些抗体敏感性虽高而特异性低的不足，收到良好效果，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

收集2009年3月～2012年3月秦皇岛市第二医院病理科肺癌伴胸水转移送检病例68例，年龄45～70岁，中位年龄63岁，64排CT均显示肺内占位病变，伴纵隔淋巴结肿大及胸腔积液。其中9例有锁骨上窝淋巴结肿大、质硬。经气管镜、穿刺活检或切取锁骨上肿大淋巴结等手段，获取组织学标本，并及时经10%中性甲醛固定，石蜡切片，经HE染色和IHC染色确定诊断为：鳞状细胞癌13例，腺癌40例，腺鳞癌6例，神经内分泌癌9例；同时获取新鲜胸水每例500mL，采用TCT制片。TCT制片设备为康柏液基细胞制片机及配套耗材，由湖南长沙康柏恩医疗科技公司提供。免疫组化染色抗体选为：TTF-1，CK7，CK14，CK18，P63，P40，CgA，Syn，CR1 （柠檬酸修复），CR2（EDTA 修复），Vimentin，CEA和MC，常规IHC染色采用 ElivisionTMPlus，DIHC染色采用 Dou MaxVision，细胞通透剂为X-100，所选试剂均购于福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 制片

将每例活检组织选一蜡块进行切片，厚约4 μm，分别切12张，裱于防脱载玻片上，60℃烤2 h，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡，入水冲洗干净。每个病例抽取新鲜胸腔积液500 mL，立即制片，分取 10 mL液体，放入一次性塑料试管，每例取36管，放入低速离心机，1500 r/min，离心10 min，吸取上清液放入洁净试管中留作冲洗液，将沉渣逐一转移到TCT保存液当中，震荡1 min，用制片机制片，肉眼见细胞层较厚时，用同例胸水离心上清液稍加冲洗，使细胞涂层变薄，立即风干固定于95%乙醇液中15 min，取出在60℃烤箱烤15 min，每例制36张TCT涂片。

1.2.2 分组及染色

将每例胸腔积液36张TCT涂片随机平均分成B、C、D三组，每组12张TCT涂片。

1.2.2.1 A组 为活检石蜡切片，一抗选择TTF-1、CK7、CK14、CK18、P63、P40、CgA、Syn、CR1（柠檬酸修复）、Vimentin、CEA和MC，设立阴阳性对照片，按ElivisionTMPlus操作方法完成免疫组化染色，DAB显色。

1.2.2.2 B组 先经HE染色，显微镜下选择合格涂片：细胞排列均匀、基本单层、目标细胞核-浆-膜结构清晰。然后去掉盖玻片，经二甲苯脱胶，梯度乙醇（由高浓度至低浓度）脱二甲苯，最后入水清洗。再将B组分成B1、B2组：要求EDTA修复的为B1组，其余为B2组。现配EDTA液（pH=9.0）按1∶50配置（一份原液和50份蒸馏水混合）适量，放入洁净高压锅中，去盖先加热至沸腾，将B1组TCT涂片放入沸腾的EDTA中，加盖继续加热至喷气2 min，自然冷却；再将配制好的柠檬酸液（pH=6.0±0.1），放入洁净高压锅内适量，开盖加热至沸腾，放入B2组TCT涂片，加盖继续加热至喷气1 min，自然冷却。安全取出抗原修复的涂片，用PBS冲洗。通过EDTA和柠檬酸高压加热修复，HE染色TCT涂片彻底退色。DIHC染色前滴加过氧化物酶阻断剂，以防止由于抗原修复导致的内源性生物素与抗体产生非特异性结合。在滴加一抗前，用X-100细胞通透剂进行处理，增加细胞的通透性，有利于抗原抗体结合。DIHC染色是采用不同颜色的显色剂，显示不同抗原成分，显色遵循先深后浅，胞膜、胞核着深色，胞质着浅色，选择好抗体搭配。本组一抗搭配：MC-Syn，MC-CgA，MC-P40，MC-CK181，MC-CK7 或MC-CK14，CR2-P40，CR1-TTF1，CR1-P63。 染色采用DouMaxVision方法，BCIP/NBT/AEC显色，其步骤按照DIHC染色要求，设立阴阳性对照片。

1.2.2.3 C组 经HE染色，显微镜选择合格涂片，去掉盖玻片，经二甲苯脱胶，梯度乙醇（由高浓度至低浓度）脱二甲苯，最后入水清洗。用0.5%盐酸及草酸溶液常温退色10 min，入水冲洗。一抗选择TTF-1、CK7、CK14、CK18、P40、CgA、Syn、CR1、Vimentin、CEA 和 MC，设立阴阳性对照片，在滴加一抗前，应先用X-100细胞通透剂进行处理，按IHC染色ElivisionTMPlus操作方法完成，DAB显色。

1.2.2.4 D组 不经HE染色直接做IHC染色，一抗选择TTF-1、CK7、CK14、CK18、P40、CgA、Syn、CR、Vimentin、CEA和MC，设立阴阳性对照片，在滴加一抗前，应先用X-100细胞通透剂进行处理，按ElivisionTMPlus操作方法染色，DAB显色。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件，计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化染色结果判读标准：着色部位正确，无背景着色，着色对比鲜明，即使有一个细胞着色也视为阳性。B、C、D三组免疫组化染色结果与组织病理A组结果比较，B组差异无统计学意义（P＞0.05）；C组差异有统计学意义（P＜0.05）；D组差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。 见表1。

3 讨论

近年来TCT检查广泛应用于临床，包括宫颈液基细胞检查、体腔腔积液、气管镜刷片及灌洗液、肿瘤穿刺液、尿液及脑脊液等。对肿瘤的诊断、鉴别诊断及肿瘤分类起着重要的作用。肺癌伴胸水转移的患者，一般失去手术机会，多采用化疗和放疗。但首先要明确是否伴胸水转移以及肿瘤的详细分类。如果能获得活检组织病理诊断为最佳，但取活检受多方面因素影响，往往很困难，只有通过胸水检查来明确诊断和分类。前言提到TCT检查较传统涂片有其优缺点，不论TCT涂片还是传统涂片，虽经HE染色诊断，但常需要借助免疫组化染色才能与间皮细胞鉴别和明确肿瘤细胞来源及分类。每张TCT涂片中存在多种形态各异的细胞，包括反应性增生的间皮细胞，有时形似癌细胞，免疫组化染色时间皮细胞不但表达CR和MC，还可表达某些角蛋白CK等多种抗原成分。在一张TCT涂片上只用一种抗原如CK（特异性低），不能区分间皮细胞和癌细胞。CR和MC敏感性虽高但特异性不高，文献报道二者敏感性可达100%，Murugan等[9]报道38例反应性间皮细胞增生病例中CR敏感度为100%，特异度为92.31%。Betta等[10]认为CR的敏感性为98%，陈颖等[11]的研究认为CR的特异性为69.5%，赵维聪等[12]报道CR及MC敏感性为100%，特异性分别为82.1%和17.9%。普遍认为CR和MC的敏感性高，而特异性相对较低且不一致。若一张TCT涂片上的不同细胞分别表达不同抗原或一个细胞不同部位同时表达两种不同抗原，就可以大大增强抗原表达的特异性和敏感性，这就是免疫组化双重染色与常规免疫组化染色的区别。郗彦凤等[8]利用BSAP/CD30标记经典型霍奇金淋巴瘤中的R-S细胞是石蜡切片，林秋霞等[12]用PCNA+NF-160的免疫双标记证明培养细胞中分裂神经元是否为成熟神经元是培养细胞，也有报道利用原位杂交和免疫组化进行细胞双标记[13-14]，均取得了良好效果。但DIHC染色同时采用抗原热修复退色技术在TCT中的应用未见报道。通过对TCT涂片免疫组化研究，发现HE染色柠檬酸或EDTA修复退色做双重免疫组化染色效果最好、确诊率高，而用盐酸退色常规免疫组化染色次之，未经HE染色的较差。分析其原因，前两种方法，都使用了HE染色，显微镜观察，选出了合格的TCT涂片，期中B组采用抗原热修复方法退掉HE染色，既不损伤抗原成分，又无染料分子阻碍抗原抗体结合；C组经HE染色后选用盐酸和草酸退色，抗原成分遭到一定程度破坏[6]，造成部分假阴性，导致确诊率下降；D组是未经HE染色，显微镜下无法选择合格涂片，存在不合格涂片，导致确诊率降低。通过对68例有组织学对照的癌性胸水做TCT检查，旨在探讨液基细胞HE染色联合DIHC染色对癌性胸水进行诊断、鉴别诊断及分类诊断的价值，结果显示抗原修复退色联合DIHC染色为最佳方法，在体腔积液TCT诊断中起者重要的作用，尤其适用于数量很有限的TCT涂片，值得借鉴。

表1 68例肺癌伴胸水转移组织学与液基细胞免疫组化染色诊断结果比较（例）

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