徐长卿提取物对损伤内皮细胞中乳酸脱氢酶、肿瘤坏死因子及白细胞介素-8活性的影响

李 阳 孙世光 谢予朋 孙晓迪 闫 荟 石亚飞

1.北京军区总医院药剂科，北京 100700；2.河北北方学院研究生部，河北张家口 075000

徐长卿为萝藦科多年生草本植物，《太平圣惠方》记载，徐长卿具有化瘀散结，降脂通络等作用[1]。临床上用于调节血脂代谢紊乱，降低血脂、防治心脑血管动脉硬化[2]。攻膜复合物C5b-9的过度活化引发的内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化发生的主要原因[3]，前期实验研究已确定了导致内皮细胞损伤的C5b-9临界浓度，即C5b-9的亚溶破剂量，本文旨在研究徐长卿提取物对损伤内皮细胞中炎症介质活性的调节作用，探究徐长卿治疗动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVEC（上海青忠贸易有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），RPMI1640 培养基（Hyclone公司），补体 C5b-6、C8、C9（德国 Merck 公司），补体 C7（美国 Sigma公司），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、白细胞介素-8（IL-8）试剂盒（南京建成），徐长卿药材（购自吉林大药房），丹皮酚标准品（北京药品生物制品检定所），标准酶标仪（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 徐长卿药材有效成分提取 称取徐长卿药材适量，置于圆底烧瓶中，加入适量50%乙醇溶液，回流提取2 h，待提取液冷却后二次回流提取1 h，放冷过滤，经冷冻干燥后，得到药材冻干粉。

1.2.2 内皮细胞损伤模型的建立[4-7]前期应用激光共聚焦显微技术已确定了导致内皮细胞损伤的C5b-9的临界浓度，现将该浓度的C5b-9组装于内皮细胞表面，具体过程如下：用2.5 mg/L的胰蛋白酶消化分离细胞，预热无血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，1000 r/min，离心 5 min。 加入纯品 C5b-6（1.6 mg/L，1 mL）和 C7（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1 h。RPMI 1640洗去未结合的补体成分，加入 C8（10 mg/L，1 mL）和C9（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1.5 h。 RPMI 1640洗去未结合的补体，将组装好的细胞接种于96孔细胞培养板中（每孔接种 1.5×104细胞），置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育1 h，使细胞稳定。

1.2.3 提取物对损伤细胞的作用 分别称取适量药材提取物冻干粉及丹皮酚标准品，用PBS缓冲溶液配制成高、中、低浓度溶液，分别用以上药物处理细胞，同时设立空白对照及模型对照组。处理后细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育96 h，收集细胞培养上清液。

1.2.4 测定上清液中各炎症介质的活性 按照试剂盒说明书，分别测定收集的上清液中LDH、TNF-α及IL-8的活性。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

细胞培养上清液中各炎症介质的分泌水平见表1。由表1可知，徐长卿提取物高剂量组及中剂量组与模型对照组比较，LDH、TNF-α及IL-8分泌水平差异均有高度统计学意义（P＜0.01），但高剂量组中各炎症介质的分泌水平与空白对照组水平接近，差异无统计学意义（P＞0.05）。丹皮酚标准品对照组与实验组结果基本一致，其中中剂量组对LDH的调节作用优于高剂量组。

3 讨论

早期研究已经证实，徐长卿药材中的主要成分为丹皮酚，占药材总量的1%左右[8-9]。前期实验研究得出50%乙醇提取可最大限度得到有效成分。赵霞等[10]通过研究丹皮酚对高脂血症大鼠的胆固醇、三酰甘油等血象指标的调节作用，得知丹皮酚可调节主动脉组织中脂质过氧化反应的发生，改善炎症细胞因子的分泌；有研究指出，丹皮酚能够抑制细胞内氧自由基的产生[11]，这可能对炎症环节产生影响；戴敏等[12]发现，丹皮酚可降低动脉粥样硬化家兔血清中TNF-α含量，抑制兔血管平滑肌细胞的增殖；周晓慧等[13]指出，丹皮酚可抑制NF-κB信号通路，从而介导黏性分子的表达。本实验以人体血管组织细胞人脐静脉内皮细胞作为实验载体，建立内皮细胞损伤模型，药物干预治疗后发现，徐长卿药材提取物可显著降低炎症因子LDH、TNF-α及IL-8的活性，进而修复内皮细胞损伤，以达到治疗动脉粥样硬化的目的。实验中设立丹皮酚标准品对照组，得出了与实验组一致的结果，进一步证实了发挥主要治疗作用的有效成分即为丹皮酚。

表1 各组上清液中各炎症介质分泌水平（±s）

表1 各组上清液中各炎症介质分泌水平（±s）

注：与空白对照组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；与模型对照组比较，**P ＜0.01；LDH：乳酸脱氢酶；TNF-α：肿瘤坏死因子；IL-8：白细胞介素-8；“-”表示无数据

空白对照组模型对照组提取物高剂量组中剂量组低剂量组丹皮酚高剂量组中剂量组低剂量组--1.60 0.80 0.40 0.20 0.10 0.05 117.85±1.65 200.49±3.31△△119.85±4.12**165.20±3.51△△**222.78±5.55△△123.53±4.80△**118.58±4.99**161.32±4.81△△**96.00±2.26 108.00±2.30△△94.75±3.19**92.81±1.78△**132.69±1.84△△98.42±0.90**105.56±2.15△△116.12±2.89△△30.88±2.50 40.98±0.60△△33.65±2.48**37.28±0.26△△**43.55±0.64△△31.52±1.20**37.12±1.37△△**37.95±0.97△△**组别 给药剂量（g/L） LDH（U/L） TNF-α（ng/L） IL-8（ng/L）

内皮细胞损伤发生后，可产生多种炎症因子，常见的有LDH、TNF-α、IL-8等，这些炎症因子可导致血管功能紊乱，阻断局部血流供应，使组织缺血缺氧坏死，进而加重内皮细胞的损伤程度[14-16]。徐长卿中的主要有效成分丹皮酚可能干预这些炎症因子的受体表达，以降低其活性，因此今后可从分子水平对该类基因的表达进行更深层次的研究。

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