柱后光化学衍生高效液相色谱法测定调味品中黄曲霉毒素

王韦岗，唐双双，陆 源，朱新生

(镇江市产品质量监督检验所，江苏 镇江 212001)

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种常见的腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮食制品及其他霉腐的有机物中，主要存在形式为B1、B2、G1、G2、M1和 M2。1993 年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一级致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质［1］。研究表明，长期食用被黄曲霉毒素污染的食物将导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病。为了防止黄曲霉毒素危害人类健康，世界各国对黄曲霉毒素在食品中的残留限量都作了严格的规定［2］。

食醋、酱油、料酒等调味品是以大米、小麦、高粱和黄豆等粮食为主要原料发酵配制而成的，在原料储存、发酵和产品生产过程中容易受到黄曲霉毒素的污染，从而危害人体健康。建立调味品中黄曲霉毒素快速有效的检测方法是保障食品安全的重要手段之一。目前，常用固相萃取柱［3，4］、免疫亲和柱［5，6］和多功能净化柱［7，8］等对食品样品中的黄曲霉毒素进行提取和净化，但由于食醋、酱油等调味品基质复杂，所以单一的净化方法并不能满足检测要求。本文介绍了采用中性氧化铝固相萃取柱结合MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱来净化样品，应用光化学衍生和高效液相色谱法同时测定调味品中的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的方法，为实验室开展黄曲霉毒素的检测提供了简便、有效的方法。

1 材料与方法

1．1 仪器及设备

Waters e2695高效液相色谱仪(主要包括2475荧光检测器，柱温箱，自动进样器，自动脱气四元梯度泵等);光化学衍生器;氮气吹干仪;Millpore超纯水系统;C18、弗罗里硅土、硅胶、中性氧化铝和石墨化碳黑固相萃取柱;多功能净化柱(MFC):MycoSep 228 AflaPat(美国Romer Labs)。

1．2 试剂

黄曲霉毒素标准品(Supelco，美国):G1、G2和B2的质量浓度为 2 μg/mL，B1的质量浓度为1.12 μg/mL，M1的质量浓度为 10 μg/mL。用甲醇配成含 40 ng/mL B1、G1和 M1，20 ng/mL B2和 G2的标准储备溶液，保存于－20℃冰箱中;亚铁氰化钾和硫酸锌为分析纯，甲醇和乙腈为色谱纯;实验用水为Millpore超纯水系统制得，18 MΩ·cm，25℃。

1．3 仪器分析条件

色谱柱:Symmetry ShieldTMRP18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 ∶乙腈 ∶水 =25 ∶20 ∶55;流速:0.8 mL/min;进样体积:20 μL;柱温:30 ℃;荧光检测器:激发波长355 nm，发射波长430 nm。

1．4 样品处理

称取2 g(精确到0.01 g)试样于50 mL容量瓶中，分别加入1 mL亚铁氰化钾(10.6%)溶液和1 mL硫酸锌(30%)溶液，摇匀后用乙腈-水混合溶液(体积比为80∶20)定容，静置沉淀30 min;移取10 mL上清液至中性氧化铝固相萃取柱内，并收集滤液至多功能净化柱的玻璃试管中，用MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱对样品进一步净化;移取1 mL净化液于另一玻璃试管中，经60℃ 加热氮气吹干，再加入1 mL流动相溶解混匀，经0.45 μm滤膜过滤后进样分析。

2 结果和讨论

2．1 提取方法的选择

黄曲霉毒素难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，而乙腈由于具有渗透性好、提取率高等优点，成为黄曲霉毒素常用的提取溶剂。虽然黄曲霉毒素难溶于水，但是提取液中少量的水可以润湿基质，增强有机溶剂在样品中的渗透力，因此，采用有机溶剂与水的混合溶液作为提取液，可以提高样品的提取效率。食醋、酱油等调味品一般由粮食发酵而成，含有大量的有机酸、氨基酸、糖分等大分子物质，成分复杂，若直接稀释进样，不但干扰物质较多，而且容易引起柱压升高，柱效下降，影响黄曲霉毒素的检测。在实验中发现，亚铁氰化钾和硫酸锌可以沉淀大部分干扰物质，得到的提取液相对干净，有利于下一步实验条件的优化。

2．2 固相萃取柱的选择

调味品中通常含有焦糖色、红曲红等色素，经过亚铁氰化钾和硫酸锌沉淀后的样品提取液颜色较深，因此需要进一步净化。通过实验，比较了C18、弗罗里硅土、硅胶、中性氧化铝和石墨化碳黑固相萃取柱对调味品中黄曲霉毒素的净化效果，结果表明:C18、弗罗里硅土和硅胶固相萃取柱对调味品中色素的祛除能力较差，且净化后杂质峰较多，会对黄曲霉毒素M1和G2的测定产生干扰;中性氧化铝和石墨化碳黑固相萃取柱对样品中的色素均有很好的吸附作用，但石墨化碳黑固相萃取柱在吸附色素的同时也吸附了样品中的黄曲霉毒素，影响了黄曲霉毒素的回收率。因此，本实验中使用中性氧化铝固相萃取柱对样品提取液进行脱色。

2．3 净化方法的选择

沉淀剂和中性氧化铝固相萃取柱虽然能祛除样品中的大部分有机物及色素，但由于调味品成分复杂，基质干扰大，且通常样品中黄曲霉毒素的含量较低，因此需要充分净化样品，以减少杂质对黄曲霉毒素测定的干扰。在上述实验基础上，采用美国Romer Labs公司的MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱，对样品中的黄曲霉毒素进一步分离纯化。多功能净化柱是一种特殊的固相萃取柱，其填料中含有亲脂性(非极性)和电荷活性(极性)成分，可有选择地吸附样品提取液中的脂类、蛋白质和碳水化合物等干扰物质，让待测化合物通过净化柱，从而达到分离纯化的目的。图1是调味品样品采用不同方式处理后的色谱图。

图1 空白调味品样品采用不同方式处理后的色谱图

2．4 线性范围和检出限

吸取适量体积黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的标准储备溶液，用甲醇稀释配成相应浓度的混合标准溶液，并按选定的色谱条件进行分析。结果表明，黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其相关系数为0.9994～0.9999，相应的线性回归方程见表1。

表1 黄曲霉毒素的线性回归方程和方法检出限

在空白样品中加入标准品，按上述方法处理样品，根据3倍信噪比(S/N)峰的响应值，得到黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的最低检出限分别为0.50 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg、0.10 μg/kg和0.50 μg/kg。混合标准溶液及调味品加标样品的色谱图见图2。

图2 (a)混合标准溶液和(b)调味品加标样品的色谱图

2．5 回收率和精密度

选取黄曲霉毒素含量低于检出限的空白食醋、酱油、糖醋汁和调味料酒样品，在样品中分别按0.50 ng/mL加入B2和G2标准溶液，按1.50 ng/mL加入B1、G1和M1标准溶液，并以上述实验方法进行样品处理和测定，考察实验方法的回收率，对加标样品重复测定6次，考察实验方法的精密度。结果表明，黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和 M1的回收率均在85%以上，相对标准偏差(RSD)为1.27% ～4.82%。回收率和精密度结果见表2。

表2 样品中黄曲霉毒素加标回收率和精密度实验结果(n=6)

3 结论

本研究采用亚铁氰化钾和硫酸锌沉淀调味品中蛋白质等干扰物质，经中性氧化铝固相萃取柱脱除提取液中的色素，并结合多功能净化柱和柱后光化学衍生技术测定调味品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的含量，该方法具有简便、快速、溶剂消耗少、回收率高等优点，为调味品中黄曲霉毒素的检测提供了实用的技术手段。

［1］柳洁，何碧英．黄曲霉毒素高效液相色谱检测方法研究进展［J］．中国卫生检验杂志，2005，15(7):891 －896．

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［3］付朝辉，黄雪祥，闵顺耕．超高效液相色谱法快速测定发酵茶叶中的黄曲霉毒素［J］．分析实验室，2009，28(6):112－115．

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［7］吴燕，朱怡平，汪国权．多功能柱净化-光化学柱后衍生高效液相色谱测定食品中黄曲霉毒素［J］．中国卫生检验杂志，2011，21(8):1865 －1866．

［8］朱孟丽．用MycoSep TM净化柱和高效液相色谱法对谷物中黄曲霉毒素 B1、G1、B2、G2的测定［J］．饲料工业，2006，27(3):36 －38．