1株拮抗真菌的生防细菌Xj11的分离与鉴定

敖 武，曾庆桂，李希茜，李 平，邓映明，朱 笃，3*

(1.江西师范大学生命科学学院江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西南昌 330022;2.江西中医学院科技学院，江西南昌 330025;3.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013)

植物病害的防治主要依赖化学农药，长期施用的结果不仅增加了病原菌耐药性，也给生态环境和植物安全使用带来了极大隐患，而利用微生物实现生物防治具有高效低毒、安全环保等众多优势，现已逐步成为植物病害防治新的有效途径之一［1-3］。本课题组在前期分离江西省井冈山自然保护区发病毛竹病原菌的过程中，获得18株细菌。其中菌株Xj11在分离平板上对生长在其周围的真菌具有较好的拮抗作用。采用对峙实验对其进行了拮抗活性的筛选和测定，并通过形态特征和培养特征观察、生理生化实验和16S rDNA序列系统发育分析进行鉴定，以期为进一步开发利用该生防菌株奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试毛竹菱斑病病原真菌菌株 小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、尖孢镰刀菌(Fuarium oxysporum)、甘蔗节菱孢菌(Arthrinium sacchari)、链格孢菌(Alternaria alternate)和炭角菌(Xylaria sp.)均为本实验室前期自行分离自井冈山发病毛竹病变组织［4］，现保藏于江西师范大学江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室。

1.1.2 培养基 拮抗细菌的分离纯化、摇瓶培养及病原真菌培养和对峙试验均采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基［4］。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 供试发病毛竹样品采集自江西省井冈山自然保护区内某毛竹栽培地，样品的处理和拮抗细菌的分离参照文献［4］的方法进行。期间挑取菌落形态各异的菌株进行纯化，转接斜面后于低温保藏备用。

1.2.2 拮抗菌株的筛选 参照文献［3］的方法，将经纯化后的细菌菌株点接在直径为90 mm的PDA平板一端，病原真菌块接在另一端，每株菌重复3块平板，置于28℃培养箱培养，当对照组病原真菌长至培养皿边缘时，观察并记录实验组有无抑菌圈产生并测量抑菌圈直径。

1.2.3 菌株Xj11的鉴定 ①培养特征:参照文献［1］的方法，对经PDA平板培养48 h后的菌株Xj11分别进行革兰染色、芽胞染色、夹膜染色、鞭毛染色、细胞壁染色，观察菌体的形态和菌落特征;②生理生化试验:按照《常见细菌系统鉴定手册》［5］中的方法，进行甲基红试验(MR)、乙酞甲醇试验(V-P)和接触酶试验等生理生化试验。参照文献［6］的方法进行糖醇发酵试验、柠檬酸盐利用试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、耐盐性试验、硝酸盐还原试验、脲酶试验、H2S产生试验、纤维素分解试验;③16S rDNA序列扩增及系统发育分析:参考文献［7］的方法提取细菌基因组总DNA，通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3')进行PCR扩增。PCR体系为(50 μL:10 ×PCR 缓冲液 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，引物 F27/R1492(10 mmol/L)2 μL，模板 DNA(约 50 g/L)1 μL，Taq 酶 2.5 U，重蒸水 41.5 μL)。PCR扩增条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1%凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测得的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对并申请GenBank登录号。下载相关菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 4.0软件以Neighbour-joining法构建分子系统发育树，从而确定菌株的亲缘关系及分类地位。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离与筛选

从分离平板上分离获得18株细菌，编号为Xj1～Xj18，其中菌株Xj11能够抑制同块分离平板上生长的真菌菌丝，显示出抑菌活性(表1)。对峙实验结果表明，其对分离获得的小麦赤霉病菌、尖孢镰刀菌、甘蔗节菱孢菌、链格孢菌和炭角菌等5种毛竹菱斑病菌均有抑制作用，尤其对小麦赤霉病菌的抑制作用最强(图1)，抑菌圈直径为(21.3 ±0.8)mm。

图1 菌株Xj11对小麦赤霉病菌的拮抗作用(右图为对照)Fig.1 Dual culture between Xj11 and G.zeae(right is control)

表1 菌株Xj11的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of strain Xj11

2.2 菌株Xj11形态特征及染色结果

内生细菌Xj11是短杆状革兰阴性细菌，有鞭毛、夹膜，无芽胞。在培养基上形成黄绿色菌落，表面湿润光滑，形成粘液，边缘整齐，菌落扁平，不透明。不同方式的染色结果见表2。

表2 菌株Xj11的染色结果Table 2 the stain result of Xj11

2.3 菌株Xj11生理生化特征

表3 菌株Xj11的生理特征Table 3 The physiological characteristics of Xj11

菌株Xj11的最适盐浓度为2%，随着盐浓度的增加生长受到抑制，在盐浓度为7%时抑制明显，在盐浓度为15%时无法生长;生长温度范围为16～37℃，最适生长温度为37℃;利用蔗糖、葡萄糖能产气产酸，果糖、麦芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇、山梨醇、甘露醇只产气不产酸(表3)。

表4 菌株Xj11的理化反应Table 4 The Physiological and biochemical reaction of Xj11

菌株Xj11生理生化反应见表4，其明胶液化且缓慢，能利用纤维素生长，产生脲酶和接触酶，能水解甘油，能使牛奶胨化后不凝固，柠檬酸盐的利用呈阳性，好氧生长;不产生硫化氢，不能水解利用淀粉，硝酸盐还原反应、V-P试验和甲基红试验呈阴性。

2.4 16S rDNA序列系统发育分析

将菌株Xj11的16S rDNA序列经PCR扩增得到1条约为1.5 kb的特征带，测序后得到1 405 bp的16S rDNA序列，将其序列相关信息提交到GenBank，获得登录号(KC522298)，将该序列与GenBank中的已有相应序列进行Blast比对。结果显示，其与伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)菌株相似性较高。进一步采用Neighbor-joining法构建菌株Xj11与相关菌株的16S rDNA序列系统进化树(图2)，分析结果显示其与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)相似性高达99%。因此，结合菌株Xj11形态和培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列系统发育分析结果，鉴定其为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，命名为Burkholderia gladioli strain Xj11。

3 讨论

伯克霍尔德氏菌是一类重要的生防菌，其在农业领域中具有生物防治及促进植物生长等多种生物学功能，有着良好的应用前景［8-9］。例如，戴沈艳等［10］从江西鹰潭红壤分离筛选出1株性状稳定的高效解磷的细菌(Burkholderia sp.)，能使土壤中被活性铁、铝等吸附固定的难溶性或不溶性的非有效态磷转化为易于被植物吸收利用的有效态磷，从而有效提高磷肥的利用率。已被开发为生物农药并实现生物防治的洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex)，其可产生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯、Cepaciamide A、Cepacidine A等多种具有抑菌活性的次生代谢物质，这些抑菌物质可以抑制细胞代谢物质的合成和破坏细胞能量的生成等［11］。

本研究报道了从江西省井冈山自然保护区发病毛竹中分离到1株具有明显抑制植物病原真菌活性的细菌Xj11。经形态特征和培养特征观察、生理生化实验和16S rDNA序列系统发育分析，将其鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌虽然是人类致病病原菌，但其对多种抗生素敏感，如喹诺酮类、氨基糖苷类和亚胺培南等，且多感染免疫功能低下的人，故其致病潜力有限［12］。此外，研究还发现该菌的发酵液稀释50倍后仍有较好的抑菌效果，表明其可产胞外强活性抑菌物质，但其拮抗机制及产生的拮抗物质及其生防抗病能力如何等尚有待于进一步研究。

图2 基于16S rDNA序列构建的菌株Xj11系统发育树Fig.2 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA sequences of strain Xj11 and related Burkholderia species

［1］ Ryu C-M，Kim J，Choi O，et al.Improvement of biological control capacity of Paenibacillus polymyxa E681 by seed pelleting on sesame［J］.Biological Control，2006，39(3):282-289.

［2］ 牟志美，路国兵，冀宪领，等.桑树内生拮抗细菌 Burkholderia cepacia Lu10-1［J］.微生物学报，2008，48(5):623-630.

［3］ 曾庆桂，颜日明，张志斌，等.1株羊蹄强拮抗内生芽胞杆菌Hg的分离鉴定［J］.江西师范大学学报(自然科学版)，2011，35(1):41-44.

［4］ 王海霞，徐小军，彭九生，等.井冈山毛竹菱斑病病原菌的分离与鉴定［J］.竹子研究汇刊，2012，31(02):42-46.

［5］ 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.

［6］ Holt JG，Krieg NR，Sneath PH，et al.Bergey's manual of determinative bacteriology ［J］.Williams and Wilkins，Baltimore，1994:39-63.

［7］ 曾庆桂，朱笃，颜日明，等.1株拮抗真菌的蛇足石杉内生细菌分离鉴定及培养条件优化［J］.微生物学通报，2008，35(4):512-518.

［8］ Coenye T，Vandamme P.Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches［J］.Environmental Microbiology，2003，5(9):719-729.

［9］ 陈旭玉，甘炳春.香蕉炭疽病拮抗细菌的分离和初步鉴定［J］.微生物学杂志，2010，30(5):48-51.

［10］沈艳，申卫收，贺云举，等.1株高效解磷细菌的筛选及其在红壤性水稻土中的施用效果［J］.应用与环境生物学报，2011，17(5):678-683.

［11］张立新，谢关林，罗远婵.洋葱伯克氏菌在农业上应用的利弊探讨［J］.中国农业科学，2006，39(6):1166-1172.

［12］Graves M，Robin T，Chipman AM，et al.Four additional cases of Burkholderia gladioli infection with microbiological correlates and review［J］.Clinical infectious diseases，1997，25(4):838-842.