基于聚邻苯二胺复合膜电位型免疫传感器的制备＊

冯春梁，柏雨辰，孙 越，杜 朋，王 璐

（辽宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029）

基于聚邻苯二胺复合膜电位型免疫传感器的制备＊

冯春梁，柏雨辰，孙 越，杜 朋，王 璐

（辽宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，辽宁大连 116029）

首先利用循环伏安法制备聚邻苯二胺（POPD）修饰碳糊电极（CPE／POPD），然后在CPE／POPD上电沉积普鲁士蓝（PB）和纳米金（GNPs），制备CPE／POPD／PB－GNPs电极，最后将羊抗小鼠IgG通过金－氨键固定在CPE／POPD／PBGNPs上，从而制得一种免疫传感器（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）.用循环伏安法和电化学交流阻抗技术对电极的修饰过程进行表征.利用所制备的免疫传感器对溶液中的小鼠IgG进行检测，结果表明，在2.0×10－5μg／L和1.0×04μg／L 2种浓度下，免疫传感器均得到了很稳定的电位响应信号，响应时间不超过3min.所制备的免疫传感器具有灵敏度高、响应速度快、检测范围宽、成本低廉等突出优点.

聚邻苯二胺；纳米金；普鲁士蓝；抗体

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：CHI660A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）；PXJ－1B数字式离子计（江苏电分析仪器厂）；PHS－3C精密酸度计（上海雷磁仪器公司）；LIP900超纯水系统（韩国Human公司）；KQ400DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；10μL微量移液器（临海市华威分析仪器有限公司）.

试剂：氯金酸、铁氰化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（上海国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸钠（沈阳新兴试剂厂）；固体石蜡（生工生物工程有限公司）；石墨粉（中钢集团上海新型石墨材料有限公司）；氯化铁、硫酸（北京化工厂）；过氧化氢、邻苯二胺（天津市科密欧化学试剂有限公司）；牛血清蛋白（BSA，北京元亨圣马生物技术研究所）；羊抗小鼠IgG、小鼠IgG（北京索莱宝科技有限公司）.实验所用化学试剂均为分析纯，用水均为超纯水.

1.2 炭糊电极的制备

将石墨粉与固体石蜡按照4∶1的比例混合均匀，在加热的状态下，将其填充到直径为9mm的聚四氟乙烯管中，管的一端用铜导线连接，压实，冷却，便制备出碳糊电极.

1.3 CPE／POPD／PB－GNPs的制备

将碳糊电极在打印纸上打磨光亮，在0.5mol／L硫酸中电化学活化后，置入40mmol／L邻苯二胺（OPD）的H2SO4溶液中，于－0.3～1.5V的电位范围内循环扫描80圈，扫速为100mV／s，制得CPE／POPD修饰电极，取出后用超纯水淋洗干净备用.

将40mL 0.04mol／L FeCl3·6H2O溶液与稍微过量的H2O2混合，得到溶液A，再将40mL 0.04mol／LK3Fe（CN）6溶液与稍微过量的H2O2混合，得到溶液B，然后在搅拌条件下将溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌3h，得到普鲁士蓝溶液.在100mL超纯水中加入1mL普鲁士蓝溶液、1mL 1%氯金酸溶液，搅拌加热至沸腾后，立即加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液，搅拌加热10min，然后移去热源，继续搅拌1 0min，冷却至室温，便得到GNPs与PB混合胶体溶液.

1.4 抗体的固定化与免疫反应检测

将CPE／POPD浸入GNPs与PB混合胶体溶液中，在1.55V的电位下，电沉积60min，取出修饰电极，淋洗干净，浸入2μg／L抗体溶液（由0.01mol／L pH值7.2的PBS配制）中，4℃下孵育4h，制得免疫传感器（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）.

以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag／AgCl电极为参比电极，利用数字式离子计检测电极电位随抗原浓度的变化.先将工作电极和参比电极置入0.02mol／L pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，搅拌1 0min，待空白电位稳定后，加入不同浓度的抗原溶液，每次加入样品后都要搅拌2min，待电位稳定后，记录电位值.

1.5 电化学表征

采用三电极体系：修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极.CV和EIS表征在5mmol／L［Fe（CN）6］4－／3－＋0.1mol／L KCl＋0.1mol／L pH值7.0PBS溶液中进行.EIS参数设定为极化电位选择开路电位，交流微扰振幅5mV，频率范围0.1Hz～10kHz，采用传统的Randles等效电路对电化学体系进行模拟，得到电荷传递电阻（Rct）.循环伏安扫描的电位范围为－0.2～0.6V，扫速为1 00mV／s.

2 结果与讨论

2.1 循环伏安法聚合邻苯二胺

在酸性、碱性及中性溶液中，OPD都能在电极表面电聚合成膜，但在碱性和中性溶液中得到的聚合膜几乎无电活性［8］.图1是在含有40mmol／L邻苯二胺的0.75mol／L硫酸中电聚合OPD过程的循环伏安曲线.从图1a）中可以看出，在第1周的扫描中，在1.0V处出现一较大的氧化峰（O3），这是由于单体OPD氧化生成自由基阳离子所致，反向扫描时并没有出现与O3对应的还原峰，而在－0.1V和0V处出现了2个还原峰R1和R2，说明生成的阳离子自由基非常活泼，随即引发聚合反应.进行第二循环扫描时（见图1b）），在－0.15V和0.1V处出现了2个氧化峰O1和O2，第1对氧化还原峰O1和R1可能是中间形成的2，3－二氨基吩嗪发生的氧化还原反应的结果，第2对氧化还原峰O2和R2应归属于最终所生成的梯型POPD的氧化还原反应.比较前2次循环扫描结果（图1a））可发现，在第二循环扫描时1.0V处的O3峰值急剧下降，说明在电极表面形成了“钝化层”，阻止了OPD单体的进一步氧化.由图1c）可见，从第2次扫描以后，随着扫描次数的增加，O3峰电流开始缓慢下降，同时，在－0.1V和0V附近的还原峰R1和R2的峰电流也逐渐下降，但是，在第10～100次扫描之间（见图1d）），R1和R2的峰电流峰逐渐增大，R2的峰电位逐渐负移，而且R1逐渐减小直至消失.从图1d）也可以看出，扫描到达第100圈时，峰O3的峰电流并没有完全降为0，仍有微小的电流，这是因为仍有一部分的单体能够到达膜表面继续进行反应.这样可使OPD单体随着扫描的进行而不断聚合到电极表面，最终形成稳定的邻苯二胺聚合膜.在pH 7.4PBS中分别对不同循环扫描圈数下制备的CPE／POPD进行CV表征时，发现循环扫描80圈时制备的CPE／POPD导电性最好.

图1 碳糊电极表面不同电聚合o－PD过程的循环伏安曲线

2.2 炭糊电极修饰过程的电化学表征

循环伏安法（CV）和电化学交流阻抗技术（EIS）是表征修饰电极的有效方法.利用CV和EIS分别对POPD／PB－GNPs，Ab以及Ag修饰电极进行逐层表征，结果如图2所示.由图2a）可见，当碳糊电极被POPD／PB－GNPs修饰后，其氧化还原峰（2）电流明显增强，说明POPD／PB－GNPs膜具有良好的电子传输性能.而固定Ab后氧化还原峰（3）电流显著减小，当固定化Ab与Ag反应形成AbAg复合物以后，氧化还原峰（4）电流几乎消失，其原因是Ab和Ag都是蛋白质，没有导电性，几乎阻断了电子传递.由图2b）可见，EIS图谱包括半圆和直线2个部分.高频区的半圆直径代表电子传递电阻Rct，低频区的直线部分表明电极过程受扩散控制.当碳糊电极（1）被POPD／PB－GNPs（2）修饰后，Rct值由779.6Ω减小到103.2Ω，表明［Fe（CN）6］4－／3－探针离子在POPD／PB－GNPs电子传递电阻很小，而固定Ab和Ag后，Rct值又依次增大到1 819Ω和2 388Ω，阻碍了电荷传输，EIS与CV表征结果一致，说明在POPD／PB－GNPs修饰PCE表面可以有效实现Ab固定化，并对Ag具有良好的免疫反应活性.

2.3 免疫反应的检测

CPE／POPD／PB－GNPs／Ab上的固定化Ab与游离抗原（小鼠IgG，Ag）发生免疫反应时，由于不同蛋白质的等电点不同，因而发生免疫反应前后电极表面上所带电荷的极性和密度会发生相应变化，使电极电位发生变化.在一定条件下，电位变化的大小与被测抗原浓度之间具有一定比例关系μ，通过测定电位便可达到检测抗原（或抗体）的目的.利用所制备的免疫传感器分别对浓度为2.0×10－5μg／L和1.0×104μg／L的小鼠IgG溶液进行检测，如图4所示，不论是浓度低至10－5数量级还是高至104数量级，均得到了很稳定的电位响应信号，而且响应时间在3min以内.

图2 碳糊电极修饰过程的CV（a）和EIS（b）表征

图3 2种浓度下免疫传感器的时间－电位响应曲线

3 结语

实验结果表明，利用循环伏安法在碳糊电极上直接聚合邻苯二胺是一种阳离子引发聚合过程，进一步在PCE／POPD上电沉积PB－GNPs不仅能够提高修饰电极的电子传输性能，而且可以通过金－氨键将蛋白质固定于碳糊电极表面，固定后的Ab对游离Ag具有良好的免疫反应活性.以廉价的碳糊电极为基础电极，利用POPD／PB－GNPs固定抗体所制备的免疫传感器有方法简便、价格低廉、响应迅速、灵敏度高、检测范围宽等突出优点，具有深入研究的价值和广阔的应用前景.

［1］ ZHU Ye，WEI CHOON ALVIN KOH，SHIM YOON BO.An Amperometric Immunosensor for IgG Based on Conducting Polymer and Carbon Nanotube－Linked Hydrazine Label［J］.Electroanalysis，2010，22（24）：2 908－2 914.

［2］ JUNG YONGWON，JEONGA JIN YOUNG，CHUNG BONG HYUN.Recent Advances in Immobilization Methods of Antibodies on Solid Supports［J］.Analyst，2008，133：697－701.

［3］ LI Xin－gui，RONG Huang－mei，DUAN Wei.Novel Multifunctional Polymers from Aromatic Diamines by Oxidative Pol－ymerizations［J］.Chem.Rev.，2002，102：2 925－3 030.

［4］ WANG Li，ZHU Hao－zhi，SONG Yong－hai，et al.Architecture of Poly（o－Phenylenediamine）－Ag Nanoparticle Composites for a Hydrogen Peroxide Sensor［J］.Electrochimica Acta，2012，60：314－320.

［5］ ZHANG Ling－yan，YUAN Ruo，HUANG Xiao－qing，et al.Potentiometric Immunosensor Based on Antiserum of Japanese B Encephalitis Immobilized in Nano－Au／Polymerized o－Phenylenediamine Film［J］.Electrochemistry Communications，2004（6）：1 222－1 226.

［6］ YANO J，TERAYAMA K，YAMASAKI S.Electrochemically Prepared Poly（o－Phenylenediamine）－Prussian Blue Composite Film for a Three－Colour Expressible ECD Material［J］.Journal of Materials Science，1996，31：4 785－4 792.

［7］ ŠVANCARA IVAN，VYT RˇAS KAREL，KALCHER KURT，et al.Carbon Paste Electrodes in Facts，Numbers，and Notes：A Review on the Occasion of the 50－Years Jubilee of Carbon Paste in Electrochemistry and Electroanalysis Carbon Paste Electrodes in Facts［J］.Electroanalysis，2009，21（1）：7－28.

［8］ 刘有芹，乐文志，薛峰峰.聚邻苯二胺负载纳米铜氧化物修饰玻碳电极的制备及表征［J］.材料导报，2010，24（8）：103－108.

（责任编辑 易必武）

Preparation of Potentiornetric Immunosensor Based on Poly（o－Phenylenediamine）Film

FENG Chun－liang，BAI Yu－chen，SUN Yue，DU Peng，WANG Lu
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Institute of Chemistry for Functionalized Materials，Liaoning Normal University，Dalian 116029，China）

Firstly，o－phenylenediamine（OPD）was electropolymerized on carbon paste electrode（CPE／POPD）by cyclic voltammetry method.Then the gold nanoparticals（GNPs）and prussian blue（PB）were deposited onto the CPE／POPD by electrodeposition technology to fabricate CPE／POPD／PB－GNPs electrode.Finally，the goat anti－mouse IgG（antibody，Ab）were immobilizeded on to the CPE／POPD／PBGNPs electrode through Au－NH－bond，and thus a potentiometric immunosensor（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）was sucessfully prepared.The modified process of the electrode was characterized by cyclic voltammetry（CV）and electrochemical impedance spectroscopy（EIS）.The immunosensor exhibited fast potentiometric response（＜3min）under the antigen concentration of 2.0×10－5μg／L and 1.0×104μg／L when it was used to detect the mouse IgG.The results of experiments showed that the immunosensor based on POPD／GNPs－PB composite film exhibited the advantages of high sensitivity，fast response，wide detection range and low cost.

poly（o－phenylenediamine）；nano gold；prussian blue；antibody

O657.1

B

10.3969／j.issn.1007－2985.2013.04.015

1007－2985（2013）04－0067－05

电化学免疫传感器由基础电极和固定化抗体（或抗原）构成，具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、价格低廉等优点，在食品工业、临床诊断、军事医学和环境监测等领域有广泛的应用前景［1］.但是，在免疫传感器的研究与应用中仍存在亟待解决的诸多问题，如抗体（或抗原）的有效固定并且能保持其生物活性，降低甚至消除抗原（或抗体）的非特异性吸附，提高传感器的再生性能等.将抗体稳定地、高活性地固定于基底电极表面，是制备免疫传感器的关键技术之一［2］.一些芳香聚合物具有良好的导电性，已成为一类固定蛋白质分子的良好载体.目前，用于固定蛋白质分子的导电聚合物主要有聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚邻苯二胺（POPD）等［3］.由于POPD比聚苯胺具有更多的氨基及亚氨基，因而能够提供更多的再修饰基团.POPD还有良好的导电性、电化学活性，在空气和水溶液中有很高的稳定性，是构建电化学免疫传感器的一种理想的功能材料［4］.近年来，纳米材料在生物传感器中的应用已受到人们的广泛关注.纳米金粒子（GNPs）具有高比表面积、强吸附力及良好的生物相容性等优异特性［5］，GNPs即可通过金－氨键与POPD修饰电极表面上的氨基结合，又可以与蛋白质分子的氨基结合，使蛋白质分子牢固的固定在基底电极上.普鲁士蓝（PB）具有良好的化学稳定性、电催化特性，且制备简单、成本低廉，在生物传感器领域被广泛用作电子媒介体［6］.

基底电极的选择是设计构建电化学生物传感器的重要内容.常用的基底电极一般都是一些惰性电极，如金、铂、玻碳电极等，但碳糊电极（CPE）应用得较少，而碳糊电极无毒、电位窗口宽、制作简单、成本低廉、表面容易更新，以碳糊电极为基底电极的电化学生物传感器具有更多的实用价值［7］.

2013－04－02

国家自然科学基金资助项目（60572009）；辽宁省教育厅高校重点实验室项目（2008S134）

冯春梁（1956－），男，辽宁岫岩人，辽宁师范大学化学化工学院教授，主要从事电化学、生物传感器、酶催化动力学研究.