兔骨关节炎模型早期关节软骨及软骨下骨生化改变及二磷酸盐的干预效应

陈海南 董启榕 杨侃 姜伟

骨关节炎(OA)是一种慢性、渐进性、退行性关节病变。表现为关节软骨细胞外基质(ECM)合成与降解失衡从而造成软骨变性破坏，最后引起各种临床症状［1］。近年来对其研究已从不同方面展开，而关节软骨及软骨下骨的生化改变也逐渐成为热点［2］。本研究通过建立兔骨关节炎(OA)早期模型，检测关节软骨退变过程中MMP-13的蛋白表达，软骨下骨组织蛋白酶K(CK)、MMP-9的变化规律，同时用新一代二磷酸盐作为干预因素，检测其效果，为临床防治该病患提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康雄性新西兰大白兔60只，体重(2.71±0.25)kg，由苏州大学医学院实验动物中心提供。

1.2 主要设备试剂 二磷酸盐(利塞磷酸钠，Risedronate)(美国LKT laboratories Inc.)，鼠抗兔MMP-13单抗由武汉博士德公司提供，鼠抗兔MMP-9单抗由北京博奥森生物科技公司提供，鼠抗兔组织蛋白酶K(CK)一抗抗体由上海泛柯化学试验公司购得。

1.3 模型复制及处理 所有动物按随机数字表法分为对照组(n=24)，模型组(n=24)，二磷酸盐组(n=12)。二磷酸盐组造模后每天皮下注射二磷酸盐(利塞磷酸钠，Risedronate sodium)0.01 mg/kg体重，模型组和对照组给以等体积的生理盐水皮下注射。2% 戊巴比妥钠按30 mg/kg麻醉，取髌骨内侧切口。模型组和二磷酸盐组暴露前交叉韧带，中间切除约5 mm。对照组同法暴露前交叉韧带，不予切断。术后5 d腹腔注射头孢唑啉钠500 mg/d预防感染。模型组和二磷酸盐组分别在造模后4 W、8 W、12 W各取8只，对照组取4只空气栓塞处死。截取包括股骨远端关节面的骨段。进行软骨MMP-13免疫组化染色，软骨下骨MMP-9和CK免疫组化染色。

1.4 关节软骨MMP-13及软骨下骨MMP-9，CK免疫组化染色检测 取股骨内侧髁远端负重关节面软骨用于MMP-13免疫组化染色，取软骨下骨段(带关节软骨)用于MMP-9和CK免疫组化染色。标本4%多聚甲醛固定，脱钙，系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，层厚5 μm连续冠状面切片。参照Pellerier［1］的方法在软骨切片中随机选择6个高倍镜视野(400倍)其中3个位于软骨表层和中上层，另3个位于软骨中下层和下层，计算每个视野中的阳性细胞数和细胞总数。用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示MMP-13的表达量。软骨下骨MMP-9，CK通过光镜下观察，细胞结构清楚，胞浆内有棕黄色颗粒且着色明显高于背景者为阳性。阳性计数:各组组织标本切片，每间隔一个高倍视野选取一个视野进行观察，每张切片观察5个高倍视野，计算阳性细胞表达数目，取其平均值。阳性细胞数＜25%为阳性(-)，25% ～50%为弱阳性(+)，50% ～75%为阳性(++)，＞75%为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件对资料进行分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，率的比较用卡方检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01为差异有非常统计学意义。

2 结果

2.1 造模术后不同时期关节软骨内MMP-13表达 模型组软骨内均可见较多的MMP-13表达阳性细胞，差异有统计学意义(P＜0.01)。关节软骨全层均见有MMP-13表达，为深棕褐色颗粒。4W时模型组MMP-13较正常和二磷酸盐干预组明显升高(P＜0.01)，而8W和12W较4W时反而有所下降。二磷酸盐干预组，阳性颗粒散在、显色浅棕黄色。四周时对照组，模型组和二磷酸盐组细胞阳性表达率为8%、94%和12%。和对照组相比，模型组阳性细胞表达数目明显增多(P＜0.01)。二磷酸盐可明显抑制细胞阳性表达。与模型组比较，二磷酸盐组阳性细胞表达数目明显减少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W的阳性细胞表达平均数目见表1。从表中见到模型组阳性细胞表达平均数较对照组和二磷酸盐组高，有统计学意义。说明二磷酸盐干预效果明显。但随着时间延后，MMP-13阳性细胞表达逐渐减少。

2.2 造模后不同时期软骨下骨MMP-9表达 各组软骨下骨都有阳性细胞表达。细胞结构清晰，胞浆内有深浅不同的浅棕黄色到深棕褐色的颗粒，且着色明显高于背景，模型组显色深、有的聚集成簇，正常对照组和二磷酸盐组阳性细胞表达少，散在，显色浅。四周时对照组，模型组和二磷酸盐组阳性细胞平均数目为分别为(1.34±0.1668)，(17.35±1.5430)，(3.34±0.1961)，细胞阳性表达率为4%、90%和16%。和对照组相比，模型组阳性细胞表达数目明显增多(P＜0.01)，细胞阳性表达率也明显升高(P＜0.01)。二磷酸盐可明显抑制细胞阳性表达。与模型组比较，二磷酸盐组阳性细胞表达数目和表达率均明显减少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W时的阳性细胞表达平均数目及表达率见表2。从表中见到模型组阳性细胞表达平均数及阳性表达率均较对照组和二磷酸盐组高，差异有统计学意义(P＜0.01)。说明二磷酸盐干预效果明显。12W较4W时比较差异有统计学意义(P＜0.01)，说明随着时间延后，MMP-9阳性细胞表达逐渐减少。

2.3 造模后不同时期软骨下骨组织蛋白酶K(CK)的表达变化 由各组数据及图可见，各组软骨下骨CK检测都有阳性细胞表达。细胞结构清晰，模型组胞浆内见棕黄色到深棕褐色颗粒。正常对照组和二磷酸盐组阳性细胞表达少。四周时对照组，模型组和二磷酸盐组在高倍视野(×400)下阳性细胞平均数目分别为(1.66±0.1696)，(18.54±1.4180)，(4.05±0.1946)。细胞阳性表达率分别为8%、90%、12%。和对照组相比，模型组阳性细胞表达数目明显增多(P＜0.01)，细胞阳性表达率也明显升高(P＜0.01)。二磷酸盐可明显抑制细胞阳性表达，与模型组相比，二磷酸盐组阳性细胞表达数目和阳性表达率明显减少(P＜0.01)。4 W、8 W、12 W时的CK阳性细胞表达数目和表达率见表3，从表中见到模型组阳性细胞表达数目和阳性表达率均较二磷酸盐组及对照组高。组间比较，有统计学意义。但随着时间延长，CK表达的阳性细胞数目逐渐减少，12 W时的表达较4 W时表达显著减少(P＜0.01)。±s)

表1 兔膝关节不稳不同时期软骨MMP-13表达变化比较(x ± s，%)

表2 兔膝关节不稳不同时期软骨MMP-9表达变化比较(

表3 兔膝关节不稳早期软骨下骨组织蛋白酶K表达变化(

3 讨论

骨关节炎(OA)是一种退行性关节病，成为老年人群面临的主要疾病，严重影响患者的生活质量［3］。骨关节炎发生的许多因素中生物学因素一直是研究的重点，对关节软骨各种成分的合成与分解平衡至关重要。基质金属蛋白酶(MMPs)广泛存在于各种结缔组织中，被分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素等五大类，其中MMP-13广泛存在于骨关节患者的关节软骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型胶原的作用是其他胶原酶的10-30倍，被认为是裂解Ⅱ型胶原纤维作用最强的酶，在OA的形成中起关键作用。而且其他许多MMP亚型对Ⅱ型胶原的降解需要通过它们起作用［4］。本实验中我们发现 OA模型组MMP-13在术后4周时有强烈的表达，术后8周时表达逐渐减弱，12周时MMP-13表达继续下降，说明其对关节软骨降解作用减弱。MMP-13表达不随软骨退变加重而持续增强的原因目前尚不清楚，可能与其调控途径不同有关。同时见到二磷酸盐组有MMP-13的明显减少，说明利塞磷酸钠对MMP-13的表达有明显的抑制作用。增加Ⅱ型胶原的含量，改善软骨结构，从而改变了软骨的退变进程［5］。

MMP-9是明胶酶中的一个重要元素，它能够将胶原酶变性裂解的Ⅱ型胶原进一步裂解。软骨下骨的MMP-9来源于破骨细胞，当其异常增多时表现软骨下骨的过度吸收，引起软骨下骨力学性能下降，抵抗外力作用下降，而同时产生的软骨下骨代偿性增生，又引起骨质硬化，骨重塑增多。使软骨下骨硬度不均匀，不能均匀传导来自关节软骨的冲击力，最后导致关节软骨损伤［4］。本实验中我们观察到，模型组术后4W、8W、12W软骨下骨MMP-9阳性细胞表达数目和阳性表达率明显较对照组和二磷酸盐增多，差异有统计学意义。提示OA模型早期破骨细胞增多，有明显的骨吸收，二磷酸盐组明显抑制了MMP-9的表达，大体与组织学结果显著好于模型组，显示了二磷酸盐通过抑制MMP-9的表达减少软骨下骨的骨转换，防止软骨下骨重塑，减少骨硬化，进而改善和维持关节软骨的营养代谢及生物力学环境。而随着时间的延长，8W、12W模型组的MMP-9阳性表达数目和阳性表达率逐渐减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示随着OA的进展骨吸收作用逐渐减弱，其机制仍不是完全清楚。

组织蛋白酶是破骨细胞分泌的一种溶酶体酶，其生理作用底物是有机骨基质中含量丰富的ColI。它通过作用于ColI蛋白的N端及C端三股螺旋处而降解骨纤维胶质，它对成骨胶原的降解能力远远高于其他各种金属蛋白酶(MMPs)，是骨吸收过程中的一个关键酶。破骨细胞分泌的组织蛋白酶K的前体蛋白在骨吸收腔隙中被激活，参与骨质的代谢。最近有报道组织蛋白酶K可能是哺乳动物中唯一能降解骨纤维胶原的蛋白酶，CK的表达伴随着整个破骨细胞分化的过程，由破骨细胞介导的骨吸收作用绝对或相对的增加超过成骨细胞的骨形成作用所导致的骨量持续丢失［6］。本实验中我们观察到，模型组术后4W、8W、12W组织蛋白酶K阳性细胞表达数目和阳性表达明显增多，显示关节不稳早期软骨下骨层破骨细胞增多，酶的表达增加，与MMP-9的表达类似。显示骨吸收作用下降。由于组织蛋白酶K对软骨下骨吸收的明显效能，因此对于如何抑制其骨吸收作用成为众多学者的研究课题，Wittrant［7］等学者进行的研究证明骨保护素是一种CK抑制剂。国内学者在用中医中药方法抑制CK的骨吸收方面也取得了可喜的成绩，他们用骨碎补总黄酮［8］、金雀异黄素［9］抑制CK的表达取得明显效果。我们在本实验中观察到，二磷酸盐利塞磷酸钠组CK表达较模型组明显减少(P＜0.01)，和正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，显示其有明显的抑制破骨细胞CK表达的作用，减少CK产生，减少软骨下骨吸收，改善软骨下骨力学性能。从而保护关节软骨。

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