EPCAM在食管鳞状细胞癌中的表达及其与预后的关系

潘群雄 苏子剑 王聪仁 庄建良 (福建医科大学附属泉州第一医院肿瘤外科，福建 泉州 362000)

食管鳞状细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一，尽管近年来在诊断和治疗方面均取得了巨大的进步，但其总体疗效仍不理想，且对于食管鳞状细胞癌的发生、发展过程及相关分子机制尚不清楚。食管鳞状细胞癌可能是一种干细胞性疾病。因此肿瘤干细胞学说的提出，为食管鳞状细胞癌的研究带来了新的希望。本研究应用免疫组织化学方法检测干细胞标志EPCAM在食管鳞状细胞癌组织中的表达，探讨可能影响食管鳞状细胞癌预后的因素，以及EPCAM在食管鳞状细胞癌癌发生、发展中可能的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取我院1995～2004年间行食管癌根治术且随访资料完整的90例病例，术前均未进行放、化疗及免疫治疗，且术后根据指南进行相应辅助治疗。其生存期从手术之日起开始计算，终止日期为死亡期或末次随访日期，截止日期为2011年1月30日。随访期限从24～84个月不等，平均随访日期为52.73个月。所有患者的手术标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别做HE染色及免疫组化染色。

食管鳞状细胞癌患者术前均未行放疗或化疗，均经术后病理组织学确诊，均有完整的临床病理资料，年龄32～75〔平均 (45±8.5)〕岁，＜60岁65例，≥60岁25例;其中男65例，女25例;高分化20例，中分化52例，低分化18例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期63例，ⅢA期27例;脉管有瘤栓13例，脉管无瘤栓77例;浸润至黏膜下层或肌层63例，浸润至食管纤维膜27例;淋巴结有癌转移28例，淋巴结无癌转移62例。

1.2 实验试剂 鼠抗人EPCAM单克隆抗体购于antibodiesonline。Elivision试剂盒，胃蛋白酶，H2O2，内源性生物素阻断试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3 实验过程 采用免疫组化Elivision法染色，严格按试剂盒说明方法操作。石蜡切片脱蜡水化，EPCAM采用EDTA抗原修复液，微波加热使之维持92℃ ～95℃15 min，室温放置20 min后自然冷切后取出玻片。3%H2O2孵育，生物素阻断剂阻断。加入一抗 CD133、EPCAM单克隆抗体，工作浓度为1∶100，二抗孵育，DAB显色，脱水，透明，封片。用已知的阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定 两位病理医师独立观察，随机采集10个有代表性的视野计数，取平均值。CD24阳性染色判断标准:胞质或胞膜有棕黄色颗粒沉着者为阳性染色。依阳性细胞百分率判定阳性强度。阳性细胞数＜10%为阴性，10%为阳性。

1.5 统计学方法运用SPSS17.0软件，EPCAM蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理病理学特征采用χ2检验;生存分析采用Kaplan-Meier法分析，不同生存曲线的差异性检验用对数秩检验;运用多因素COX模型法来综合评价和权衡各因素对预后生存的影响。

2 结果

2.1 EPCAM在食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的表达免疫组织化学染色显示癌旁组织EPCAM少数呈弱阳性表达，食管鳞状细胞癌组织CD24明显表达，阳性定位于细胞膜上，部分细胞细胞质亦染色(图1)，其他位置未见染色。癌组织与癌旁组织CD24阳性表达差异具有显著性(67.78%vs 21.11%，χ2=11.378，P=0.000)。

图1 EPCAM在不同组织中的表达(DAB)

2.2 EPCAM与食管鳞状细胞癌病理参数的关系 食管鳞状细胞癌组织EPCAM表达与患者的年龄、性别、病理分化程度、TNM分期和淋巴结转移无关。浸润程度较深的癌组织中CD24表达水平明显高于对应组(P＜0.05)，见表1。

表1 EPCAM阳性表达与食管鳞状细胞癌病理参数的关系(n)

2.3 食管鳞状细胞癌组织中EPCAM蛋白阳性表达与患者生存时间的关系 表2示EPCAM表达强阳性食管鳞状细胞癌患者生存率明显低于EPCAM表达强度较低组(χ2=18.730，P=0.000)。

表2 EPCAM表达与食管鳞状细胞癌总生存率的关系

2.4 COX比例风险模型分析 对可能影响食管鳞状细胞癌预后的8个相关因素:EPCAM、患者的年龄、性别、组织学分级、浸润深度、有无淋巴结转移，有无脉管浸润，TNM分期，进行多因素COX模型分析，结果显示，有无淋巴结转移、浸润深度和EPCAM是影响肝癌预后的因素(P＜0.05，表3)。

表3 食管鳞状细胞癌患者临床病理特征多因素Cox回归分析结果

3 讨论

复发与转移是影响食管鳞状细胞癌患者预后的根本原因。肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞，在肿瘤发展中充当干细胞角色，具有自我更新和无限分化、增殖潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着关键性作用，决定肿瘤的形成、复发和转移;而其余大多数肿瘤细胞经过短暂的分化后最终死亡。人类肿瘤干细胞首次报道给我们带来了希望〔1〕。

EPCAM表达于人类部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮肿瘤细胞表面。Went等〔2〕用免疫组化法研究了3 347份组织标本，常见肿瘤EPCAM的表达情况:食管癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌均达到或接近100%;乳腺癌73%，肾癌51.8%，肝细胞癌14.9%，皮肤鳞癌4.7%，肉瘤4.8%;黑色素瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤等无表达。Du等〔3〕用免疫组织化学染色方法研究发现，EpCAM在转移性胃癌较非转移性胃癌明显高表达。Osta等〔4〕用定量RT-PCR检测乳腺正常组织和癌组织EpCAM-mRNA的表达情况，发现癌组织表达量是正常组织的100～1 000倍。与正常组织相比，62.5%的舌鳞状细胞癌明显过表达EPCAM，过表达EPCAM与肿瘤大小、区域淋巴结转移高度正相关〔5〕。EPCAM基因中具有rs1126497 CT表型的喉癌细胞具有更强的侵袭能力，并与复发与进展状态相关。在原始视网膜母细胞上观察到 EPCAM、CD24、ABCG2共表达〔6〕。实验也证实了EPCAM促进肿瘤细胞的侵袭转移。实验通过小分子干扰RNA(siRNA)下调EPCAM的表达，在体外可明显抑制胃癌、喉癌、舌鳞状细胞癌肿瘤细胞的黏附、浸润和迁移，在体内可抑制胃癌细胞的转移能力用〔3～5〕。在体外实验中，与EPCAM阴性细胞相比，EPCAM阳性的细胞具有更强的增殖能力和神经球形成能力〔6〕。通过T细胞介导的EPCAM×CD3抗体能明显使原始视网膜母细胞增殖能力减弱，并使IFN-γ、IL-10、IL-2、TGF-β 等效应性细胞因子分泌减少〔6〕。

Sano等〔7〕对151例食管鳞状细胞癌分析发现40.4%的食管鳞状细胞癌表达CD24，CD表达与淋巴结转移、病理分期、转移的淋巴结数目、淋巴管和脉管浸润正相关，CD24表达与无病生存期相关，多因素分析表明CD24是独立的预后指标，与本文结果一致。

EPCAM介导细胞间和细胞内的同质黏附，具有加快细胞周期、促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸等多种生物学功能。Litvinov等〔8〕将EPCAM cDNA转染入细胞间无黏附功能的鼠成纤维细胞L细胞，细胞形态发生了变化，细胞获得黏附功能并集成细胞串。EPCAM的黏附作用较E-钙黏蛋白(E-cadherin)松散，且为钙离子非依赖性，EPCAM对E-cadherin介导的黏附有负性调节作用。细胞分化过程中，EPCAM的黏附作用取代了 E-cadherin保持细胞正常状态，增殖期过后 EPCAM表达下降，E-cadherin高表达介导细胞黏附引发细胞的分化。Munz等〔9〕研究显示，EPCAM过表达可上调癌基因C-myc和周期素A、E，加快细胞周期，促进细胞增殖。因而设想EPCAM表达的调节增强E-钙黏蛋白等介导的细胞间黏附，从而影响细胞的迁移、侵袭和增殖。最近研究解释了EPCAM在人肿瘤及肿瘤增殖细胞高水平表达与预后差密切相关，EPCAM本身有致瘤活性，在于其胞内结构域EPICD(含有短的26个氨基酸)，通过Wnt-β-catenin信号转导途径实现核转录的〔10〕。此途径的一些成分参与EPCAM信号转导和基因调节，对于正常及恶性干细胞具有显著意义。

目前EPCAM已用于肿瘤的诊断与治疗。Zhang等〔11〕用定量RT-PCR检测60例胸、腹腔渗出液脱落细胞EPCAM-mRNA，发现其诊断恶性渗液的敏感性、准确性分别为75.0%和81.6%，均高于细胞学检查的55.6%和67.3%，因而认为，Ep-CAM-mRNA是鉴别良恶性渗液的敏感指标。在一项开放、多中心的临床I/Ⅱ临床实验中，结肠癌、胃癌和胰腺癌腹膜转移患者中，应用抗EPCAM单抗可抑制肿瘤进展〔12〕，给EPCAM阳性的上皮源性肿瘤(胃肠道、卵巢、NSCLC等)及恶性腹胸水的免疫导向治疗带来了新的希望。目前，其Ⅱ、Ⅲ期临床实验已完成，耐受性良好，副作用少或轻微。

1 Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice〔J〕.Nature，1994;367(6464):645-8.

2 Went PT，Lugli A，Meier S，et al.Frequent EPCAM protein expression in human carcinomas〔J〕.Hum Pathol，2004;35(1):122-8.

3 Du W，Ji H，Cao S，et al.EPCAM:a potential antimetastatic target for gastric cancer〔J〕.Dig Dis Sci，2010;55(8):2165-71.

4 Osta WA，Chen Y，Mikhitarian K，et al.EPCAM is overexpressed in breast cancer and is a potential target for breast cancer gene therapy〔J〕.Cancer Res，2004;64(16):5818-24.

5 Yanamoto S，Kawasaki G，Yoshitomi I，et al.Clinicopathologic significance of EPCAM expression in squamous cell carcinoma of the tongue and its possibility as a potential target for tongue cancer gene therapy〔J〕.Oral Oncol，2007;43(9):869-77.

6 Mitra M，Kandalam M，Harilal A，et al.EpCAM is a putative stem marker in retinoblastoma and an effective target for T-cell-mediated immunotherapy〔J〕.Mol Vis，2012;18:290-308.

7 Sano A，Kato H，Sakurai S，et al.CD24 expression is a novel prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Ann Surg Oncol，2009;16(2):506-14.

8 Litvinov SV，Velders MP，Bakker HA，et al.EPCAM:a human epithelial antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule〔J〕.J Cell Biol，1994;125(2):437-46.

9 Munz M，Kieu C，Mack B，et al.The carcinoma-associated antigen Ep-CAM upregulates c-myc and induces cell proliferation〔J〕.Oncogene，2004;23(34):5748-58.

10 Jaenisch R，Young R.Stem cells，the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming〔J〕.Cell，2008;132:567-82.

11 Zhang KH，Cao F，Fu QB，et al.Detection of mRNAs of GA733 genes byRT-PCR in exfoliated cells of pleural and peritoneal effusions and its clinical values〔J〕.Int Med，2007;46(18):1489-94.

12 StrÖhlein MA，Lordick F，Rüttinger D，et al.Immunotherapy of peritoneal carcinomatosis with the antibody catumaxomab in colon，gastric，or pancreatic cancer:an open-label，multicenter，phase I/Ⅱ trial〔J〕.Onkologie，2011;34(3):101-8.