重组溶葡萄球菌酶泡腾栓在母猪体内的药动学与阴道内残留消除研究

叶贵子 张幼定 陆 珉 李国栋,2 张继恩孙永学 曾东平 陈 超 黄青山,4

（1昆山博青生物科技有限公司，江苏省昆山市 215316；2上海高科联合生物技术研发有限公司，上海市 201206；3华南农业大学兽医药理研究室，广东省广州市 510000；4复旦大学生命科学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海市 200433）

重组溶葡萄球菌酶泡腾栓在母猪体内的药动学与阴道内残留消除研究

叶贵子1张幼定1陆 珉1李国栋1,2张继恩1孙永学3曾东平3陈 超3黄青山1,4

（1昆山博青生物科技有限公司，江苏省昆山市 215316；2上海高科联合生物技术研发有限公司，上海市 201206；3华南农业大学兽医药理研究室，广东省广州市 510000；4复旦大学生命科学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海市 200433）

通过双抗夹心酶联免疫学方法，采用药代动力学软件3p97，分别在健康和患阴道炎猪体进行重组溶葡萄球菌酶 （r LSP）药代动力学及阴道黏液中活性研究分析，对静脉注射r LSP的药物浓度-时间数据进行最佳模型拟合。结果表明，健康和患阴道炎母猪经静脉注射r LSP（400 U）后，消除半衰期分别为36.10分钟和40.36分钟。健康和患阴道炎母猪经阴道给药r LSP泡腾栓 （400 U）后，试验母猪血液中均未检测到酶活性,说明r LSP经阴道内黏膜吸收后在血液中没有药物蓄积。健康母猪和患病母猪在给药后36小时阴道内黏液中均能检测到酶活性 （分别为7.34 ng/mL和4.45 ng/mL），而在第48小时均未检出，表明该药物在阴道内至少保持36小时的活性，且作用48小时后无残留。

r LSP泡腾栓；母猪阴道炎；药代动力学；阴道内残留

母猪阴道炎是母猪繁殖障碍病中的主要疾病之一，此病多发于产后，患猪若得不到及时有效的治疗，往往会转为隐性或慢性感染，致使泌乳量减少、无乳或乳汁质量差，不愿哺乳，哺乳仔猪拉稀，发育不良[1]。引发猪阴道炎的主要病原体有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、霉菌及寄生虫等[2]。预防和治疗母猪产后阴道炎有利于规模化猪场提高生产水平，增加养殖效益。调查结果显示，母猪阴道炎发病率高，尤其规模化猪场发病率可达到12%[3]，且治愈率低。猪呼吸与繁殖障碍综合征的发生也大大增加了本病的治疗难度。重组溶葡萄球菌酶 （rLSP）能够迅速裂解和杀死大多数G+菌和部分G-菌，尤其对耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（MRSA）等有较强的杀菌能力[3,4]，通常用于治疗多种耐药菌引起的感染[5,6]。国内张继恩等[7]将rLSP应用到奶牛子宫内膜炎治疗领域，并在临床上取得很好的效果。但目前尚缺少相应的生物新型药物治疗母猪阴道炎。防治母猪阴道炎常用的方法是在饲料中添加药物和给母猪注射抗生素，前者已经在多个地区被禁用，而抗生素的耐药性难题始终无法解决。为此新的替代物应运而生，如微生态制剂、中药、酶制剂等。rLSP泡腾栓剂是一种以rLSP为主要成分的新型栓剂剂型，临床用于治疗母猪阴道炎[8]。

本研究使用rLSP泡腾栓分别对健康和患阴道炎母猪进行阴道给药，对rLSP在血液中的药动学和阴道黏液中的残留情况加以研究，为阐明该药物经阴道内黏膜吸收后的体内药动学、制定该药物的最高残留限量与休药期提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品与试剂

rLSP标准品 （0.575 mg蛋白/瓶，批号 20101201，纯度≥98%），rLSP冻干粉 （400 U/瓶，批号 20110201），rLSP泡腾栓 （200 U/粒，批号20110401），上海高科联合生物技术研发有限公司；辣根过氧化物酶 （HRP）、弗氏完全佐剂，Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG，华美生物工程公司；96孔酶标板，Becton Dickinson Labware Europe公司；550型酶标仪，BIO-RAD公司；AKTA explorer、HiTrap Protein A亲和层析预装柱，Pharmacia公司；邻苯二胺OPD，中国医药集团上海化学试剂公司；吐温-20，上海化学试剂公司；牛血清白蛋白 （BSA），上海伯奥生物科技有限公司。

1.1.2 试验动物

新西兰大白兔，雄性，2只，体重分别为2.32 kg和2.40 kg，第二军医大学试验动物中心提供。

健康母猪和经临床诊断患有阴道炎的母猪各8头，品质为二元杂长白，胎次均在第5～8胎之间，体重在175～186 kg之间，由广东省原种猪场提供。

1.2 方法

1.2.1 抗体的制备、纯化与签定方法[9]

参照Huang[10]的方法进行抗体的制备、纯化与鉴定。

1.2.2 夹心ELISA方法

参照小Huang[10]的方法进行夹心ELISA方法的建立。

参照陆锦春[11]的方法进行标准曲线的制作和方法灵敏度的测定。

1.2.3 添加回收率试验

用正常猪血清和阴道内黏液配制成浓度为250、50、5 ng/mL的rLSP标准品溶液各3份作为样品，离心后取上清液用双抗夹心ELISA法检测，根据其与标准曲线相应点的吸光值之比计算回收率。

1.2.4 药物动力学试验

1.2.4.1 给药剂量

取健康母猪和经临床确诊患阴道炎的母猪各8头，正交设计后分别进行静脉注射和阴道给药。将400 U rLSP冻干粉用生理盐水稀释后经耳缘静脉注射给药，将2粒200 U的rLSP泡腾栓使用特制阴道输入器给药。

1.2.4.2 动物分组和样品采集

⑴血样采集：所有试验母猪在给药前 （0时）和给药后5、15、30分钟，1、2、4、8、12、24小时经前腔静脉采血3mL，制备血浆，于-18℃保存待测；⑵阴道内黏液采集：阴道给药的健康及患病母猪在给药前，给药后12、24、36、48、72小时使用灭菌用具从阴道内采集黏液约0.2～0.5 mL，于-18℃保存，待测阴道内黏液中rLSP活性。

1.2.4.3 样品中酶活性检测

血浆和阴道黏液中rLSP活性采用1.2.2建立的ELISA检测方法进行样品前处理与测定[11]。

1.2.4.4 数据分析

药时数据采用中国药理学会数学专业委员会编制的3p97药代动力学程序软件进行曲线拟合，采用Marquardt法对一、二、三房室分别以权重1、1/C、1/C2进行计算，根据残差平方和WSS与最小AIC值判断最适药代动力学模型，并计算相应的药代动力学参数。

2 试验结果

2.1 夹心ELISA方法

2.1.1 标准曲线及灵敏度

以样品吸光值的平均值A对样品浓度对数值Lg（C）做直线回归，得回归方程 A=0.1273Lg（C）+0.1714，R2=0.9885。

分别读取母猪血浆和阴道黏液3个空白对照孔的A值，计算其平均值及标准偏差 （S）。按照结果大于 （A+10S）判定为阳性，检测下限分别为0.98 ng/mL和1.95 ng/mL。

2.1.2 添加回收率

用上述已建立的双抗夹心ELISA法测定经血浆、黏液稀释的rLSP各浓度标准品的A值，根据其与标准曲线对应点的A值之比计算回收率 （表1），添加浓度为5、50、250 ng/mL，母猪血浆和阴道黏液平均回收率范围分别为103.92%～115.81%和87.93%～93.36%，变异系数范围分别为8.80%～12.53%和8.42%～11.48%，结果表明检测方法可满足分析要求。

表1 母猪血浆和阴道黏液中rLSP回收率和变异系数 （n=3）

2.2 药代动力学

2.2.1 健康和患病母猪静脉注射给药后血液中rLSP分析

所有给药动物临床未见异常反应，进食、呼吸、排泄等正常。母猪经阴道给药组在不同时间点采血检测rLSP，结果均低于检测下限。静脉注射组检测结果见表2。8头母猪给药前 （0小时）和给药后240分钟 （4小时）均未检测到rLSP，给药后5分钟第一次采血检测的rLSP浓度最高，说明药物经静脉注射进入血液后吸收迅速。

表2 健康与患阴道炎母猪静脉注射400 U rLSP的血液分析结果 （ng/m L）

对静脉注射rLSP的药物浓度-时间数据采用3p97软件进行药代动力学分析，主要动力学参数见表3，由表可知，健康和患病母猪经静脉注射400U rLSP后，消除很快，消除半衰期（t1/2Ke）分别为36.1分钟和40.36分钟，均小于0.7小时，与平均滞留时间 （MRT）相一致。

表3 健康与患阴道炎母猪静脉注射400 U rLSP的主要动力学参数

表4 健康与患阴道炎母猪阴道给药后黏液中rLSP分析结果 （ng/m L）

2.2.2 患病母猪经阴道给药后阴道黏液中rLSP分析

分别对健康母猪和患病母猪阴道内灌注400 U泡腾栓剂后,于不同时间点采集黏液检测rLSP，检测结果见表4。由表中可见健康母猪和患病母猪给药后36小时阴道内黏液中均能检测到rLSP，说明rLSP能在阴道内保持一定时间的活性，而在第48小时时黏液中残留活性均低于检测限，说明48小时后无药物残留。

3 结论与讨论

当前国内外对母猪阴道炎的治疗方法主要有消毒剂治疗，抗生素注入，或者两者相结合治疗。消毒剂冲洗常用1 000 ppm高锰酸钾或者500 ppm新洁尔灭冲洗阴道或者洗必泰栓给药治疗。抗生素注入国内主要用土霉素注入剂，国外则通常在分离致病菌后进行药物敏感性测试再选用四环素类、磺胺类、青霉素类、氨基糖苷类或呋喃类抗生素。消毒剂治疗由于通常要进行大量冲洗，黏膜受刺激较大，外阴红肿强烈且治疗效果不佳。抗生素类药物治疗会抑制阴道内有益细菌的正常生长，破坏阴道内的微生态平衡，致病菌大量繁殖，增加了治疗难度；更为严重的是，猪与人之间存在交叉感染，已经引发了对于猪将成为人类MRSA感染宿主的担忧，为此，养猪业急需治疗母猪阴道炎的替代药物出现。陆锦春[11]等研究了rLSP在患有子宫内膜炎奶牛体内的药代动力学与残留特征，其研究表明溶葡萄球菌酶在奶牛体内消除很快 （消除半衰期为29.945±1.844分钟）。给健康或患病奶牛子宫内灌注高剂量rLSP，于不同时间点采集其血液、牛奶和子宫黏液进行含量检测表明，经子宫黏膜吸收后，血液和牛奶中没有药物蓄积；静脉注射rLSP后不同时间点的牛奶中也没有药物蓄积，此结果推动了rLSP在奶牛子宫内膜炎治疗方面的实施应用。本研究结果表明rLSP在母猪体内的药动学和阴道内黏液中酶活性均有良好表现，这将推动rLSP泡腾栓剂在治疗母猪阴道炎领域中的应用，有望成为有效的抗生素替代产品。

[1]林莉，王德容，陈勇，等.“蒲公英散”治疗母猪阴道炎的疗效观察.畜牧市场，2010（5）：50-52.

[2]Climo MW,Ehlert K,Archer GL.Mechanism and suppression of lysostahin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus.Antimicrob Agents Chemother,2001,45:1431-1437.

[3]朱志坚.中西药产道配合直肠给药法治疗母猪产道感染.中兽医学杂志，2006（2）：36-37.

[4]Dajcs JJ,Thibodeaux BA,Hume EBH,et al.Lysostaphin is effective in treating mehicillin-resistant Staphylococcus aureus endophthalmitis in the rabbit.Curr Eye Res,2001,22:451-457.

[5]Schindler CA,Schuhardt VT.Lysostaphin:a new bacteriolytic agent for the Staphylococcus.Proc Natl Acad Sci U.S.A,1964,51（3）:414-421.

[6]Yang XY,Li CR,Lou RH,et al.In vitro activity of recombinant lysostaphin against Staphylococcus aureus isolates from hospitals in Beijing,China.Journal of Medical Microbiology,2007（56）:71-76.

[7]张继恩，史为民，吴聪明，等.rLSP对奶牛子宫内膜炎的疗效研究.中国兽药杂志，2009，43（3）：17-23.

[8]伍树松，李朝军.浅谈规模猪场母猪子宫内膜炎的防治.广东畜牧兽医科技，2009（34）32：26-28.

[9]李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992：235-237.

[10]Huang Q,Zhang J,Wu H,et al.Detection of recombinant lysostaphin using antibody sandwish enzyme-linked immunoadsorbent assay.Chinese Journal of Biotechnology,2007,23（1）:117-121.

[11]陆锦春，陈华鹏，马怀彦，等.rLSP在子宫内膜炎奶牛体内的药代动力学与残留研究.中国乳业，2012（2）：40-44.

S859

A

1673-4645（2013）03-0056-03

2012-12-10