副猪嗜血杆菌病的诊断实例
2013-09-12葛向平赵姗姗
葛向平 赵姗姗
（山东省胶州市畜牧兽医局，山东省胶州市 266300）
副猪嗜血杆菌病的诊断实例
葛向平 赵姗姗
（山东省胶州市畜牧兽医局，山东省胶州市 266300）
对山东省某猪场疑似患副猪嗜血杆菌病的猪进行实验室诊断的结果表明，分离到的病原菌为革兰氏阴性杆菌，经PCR鉴定，其扩增片段与目的片段大小相符，进而确诊为副猪嗜血杆菌病。
副猪嗜血杆菌病；实验室诊断；PCR
副猪嗜血杆菌 （Haemophlius parasuis，HPS）又称猪革拉斯氏病 （Glasser's disease）[1]，主要临床症状为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱。按Kieletein-Rapp-Gabriedson（KRG）琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为l5个血清型，另有20%以上的分离株血清型不确定。我国主要以血清型4、5和l3最为流行[2]。在基层养殖中，确诊该病有利于及时采取正确的防治措施控制疾病，从而减少经济损失。
1 材料与方法
1.1 病料来源
山东某猪场送检的疑似副猪嗜血杆菌病病料 （心血、肺、淋巴结、关节液等）。
1.2 材料与试剂
TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000等 （大连宝生物工程有限公司）；胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB）培养基 （美国BD公司）。
1.3 主要仪器
PTC-2000型PCR仪 （美国MJResearch公司）；凝胶成像系统 （Alpha Innotech公司）；2A200型电泳仪 （Amersham公司）。
1.4 引物设计
根据Simone Oliveira等[3]报道，利用Premier 5.0软件设计1对引物，扩增产物长度为822 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 菌种分离与纯化
无菌采集病猪的心包积液、胸腔积液、关节液和心血，划线接种于含0.01%NAD和5%新生牛血清的TSA培养基上，置于37℃培养箱培养24～48小时，挑取优势菌落染色镜检。
1.6 PCR鉴定
1.6.1 细菌DNA模板的制备
将疑似菌落接种于含0.001%NAD和5%新生牛血清的TSB培养基中，置于37℃、180转/分摇床上培养24小时；取被检菌株菌液以10 000转/分离心5分钟，弃上清液，用无菌水悬浮沉淀，涡旋后于沸水中煮沸10分钟，-20℃冻结；待融化后，10 000转/分离心5分钟，取上清液作模板进行PCR 扩增[4]。
1.6.2 组织DNA模板的制备
向心脏、肺脏等组织中加入适量PBS溶液进行研磨，5 000转/分离心5分钟，将上清液、心包液、关节液一同进行组织DNA提取。500μL心包液、关节液和组织上清液中加入50μL 10%的SDS溶液和10μL 50μg/mL的蛋白酶K，56℃水浴2小时；加入200μLTris饱和酚，充分混匀后12 000转/分离心15分钟；取上清于一个新离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200μL，充分混匀后12 000转/分离心15分钟；取上清于一个新离心管中，加入200μL氯仿，充分混匀后12 000转/分离心15分钟；取上清于一个新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20分钟，12 000转/分离心15分钟，弃上清；加入70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干后加入20μL灭菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。
1.6.3 反应体系和反应条件
25μL体系：细菌DNA模板或组织DNA模板3μL、10倍 PCR缓冲液2.5μL、dNTP（10 mmol/L）0.5μL、引物各1μL（25mmol/L）、TaqDNA聚合酶0.3μL。阴性对照不加模板，以等量灭菌水代替。
反应条件：94℃预变性5分钟、94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分钟，34个循环，最后72℃延伸10分钟，2%琼脂糖凝胶电泳后观察是否有目的条带。
2 结果与分析
2.1 细菌形态
将纯化好的细菌接种于含5%牛血清和0.001%NAD的TSA培养基上，经37℃培养24～48小时后，挑取优势菌落染色镜检，观察到呈革兰氏阴性小球杆菌，老龄培养物呈多形态 （细小杆状、短链状和长丝状） （图1）。
2.2 PCR鉴定结果
用HPS特异性引物进行PCR扩增，从菌液和病猪组织中均扩增获得了长度为822 bp的DNA片段 （图2）。
3 讨论
通过对分离的病原菌进行染色镜检和PCR鉴定，确诊该猪场病猪所得为副猪嗜血杆菌病。
该病给养猪业带来了巨大的经济损失，因此，加强对该病的预防刻不容缓。养殖户应加强饲养管理与环境消毒，注意保温，减少各种应激因素；对发病猪群要进行紧急预防接种；在疾病流行期间，有条件的猪场在仔猪断奶时可暂时不混群；在猪群断奶、转群、混群或运输前后可在饮水中加入维生素C等，同时在饲料中添加组合药物。
[1]Olvera A,Cerdà-Cuéllar M,Aragon V.Study of the population structure of Haemophilus parasuis by multilocus sequence typing.Microbiology,2006,152（12）:3683-3690.
[2]斯特劳.猪病学.刘文军，张中秋，等译.（第8版）.北京：中国农业大学出版社，1998：407-416.
[3]Oliveira S,Galina L,Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections.JVet Diagn Invest,2001,13（6）:495-501.
[4]尹秀凤，姜平，邓雨修，等.副猪嗜血杆菌病分离与鉴定.畜物与兽医，2004，36：6-8.
S858.28
A
1673-4645（2013）03-0052-02
2013-01-21
