8-溴-7-甲氧基白杨素对顺铂耐药卵巢癌A2780/DDP 细胞凋亡的影响

张秀琴，谢朝晖

(1.邵阳市中心医院妇产科,湖南 邵阳422000,2.长沙卫生职业学院，湖南 长沙 410100）

卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的疾病。由于一线化疗后顺铂耐药的存在造成卵巢癌患者五年生存率仅为20%～ 30%，因此克服卵巢癌的化疗耐受性对提高卵巢癌临床治疗效果具有重要意义。最近有研究报道Akt 是卵巢癌细胞对顺铂敏感性的重要决定因素。Akt 能促进细胞存活、抑制细胞凋亡并且调节卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[1-3]。Akt在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，这将直接导致细胞对凋亡诱导剂的敏感性降低[4-5]。

8-溴-7-甲氧基白杨素(8-bromo-7-methoxychrysin,BrMC)是白杨素的一种衍生物。已有研究表明BrMC 对结肠癌、胃癌以及肝癌细胞等在内的多种肿瘤细胞具有较白杨素更强的抑制增殖和诱导凋亡作用[6-8]。本文研究BrMC 对顺铂耐药卵巢癌细胞株A2780/DDP 细胞凋亡的影响，并进一步探讨在此细胞凋亡过程中Akt 蛋白磷酸化水平的变化，以期为探索临床顺铂耐药卵巢癌患者的新辅助治疗方案提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

BrMC 按照文献[8]所述方法在湖南师范大学医学院药物化学实验室制备(分子量：347，性状：黄色晶体，纯度：99.0%)，碘化丙啶与白杨素购自Sigma公司；细胞死亡ELISA 检测试剂盒购自罗氏公司；小鼠抗人p-Akt、total Akt和β-actin 一抗以及辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 抗体购自美国Santa Cruz 公司；ECL Western blot 检测试剂盒购自NENTM Life Science。

1.2 细胞培养

人卵巢癌A2780/DDP 细胞购于中国典型培养物保藏中心（中国武汉市），用含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基，加100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 PI 染色FCM 分析

按照文献[9]方法，A2780/DDP 细胞以无血清培养基培养24 小时，分别加入含不同浓度的BrMC(2.5、5.0和10.0 μmol/L)的培养液培养48 小时；50.0 μmol/L 白杨素作为凋亡诱导剂对照；0.1%DMSO 作为溶媒对照。收集细胞，用磷酸盐缓冲液制备单细胞悬浮液，再用冷的磷酸盐缓冲液洗两次，700mL/ L的酒精溶液固定，4℃放置过夜，碘化丙啶（PI）染色，用EPICS XL 型流式细胞仪(美国COULTER 公司) 测定10000 个细胞的DNA 含量，SYSTEM II 软件分析细胞凋亡率。

1.4 组蛋白/DNA 碎片的ELISA 检测

根据厂商提供的说明书描述的实验步骤操作，用细胞凋亡ELISA 检测试剂盒检测经BrMC 处理后的细胞凋亡程度。用EXL-800 型酶联免疫检测仪，以405 nm 波长测定吸光度(A)值。

1.5 Western Blot 分析

收集受试物处理细胞，用PBS 洗涤3 次，加入含有0.1 mol/L的NaCl，0.01 mol/ L的Tris-Cl（pH值7.6），0.001 mol/ L的乙二胺四乙酸（pH 8.0），1μg/mL 抑肽酶，100 μg/mL 苯甲基磺酰氟的细胞裂解液溶解细胞，然后，在4℃下13 000 r/min 离心10 分钟。取上清液并加入等容积的SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水中孵育10 分钟，然后，进行10%的SDS-PAGE 电泳，转移到PVDF 膜上。PVDF 膜在含50 g/ L的脱脂牛奶的TBST 缓冲液中常温下处理2 小时，然后，分别与p-Akt、total Akt和β-actin 一抗(1：2000 稀释) 4℃孵育过夜。经过TBST 洗膜30分钟，加入相应的二抗在室温下孵育1 小时，接着用TBST 缓冲液洗膜三次，每次15 分钟。结果用增强型化学发光试剂(ECL detection kit)显示，β-actin作为内参。

1.6 统计学分析

实验数据录入SPSS 15.0 for windows evaluation 软件，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差表示，用One Way ANOVA 行方差分析。P＜0.05 为统计学意义显著标准。

2 结果

2.1 BrMC 对A2780/DDP 细胞凋亡率的影响

PI 染 色FCM 分 析 结果 显 示，BrMC(2.5、5.0、10.0 μmol/L) 作用48h，A2780/DDP 细胞凋亡率增加，呈剂量依赖性。50 μmol/L 白杨素诱导细胞凋亡作用强度与5.0 μmol/L BrMC 相当，但明显低于10 μmol/L BrMC。(图1)。

图1 BrMC 对人卵巢癌A2780/DDP 细胞凋亡率的影响

2.2 BrMC 对A2780/DDP 细胞组蛋白/DNA 碎片含量的影响

细胞凋亡ELISA 检测试剂盒测定结果表明，BrMC (2.5、5.0、10.0 μmol/L) 处 理的人 卵 巢 癌A2780/DDP 细胞中组蛋白/DNA 碎片含量增加，呈浓度依赖性(图2)。

图2 BrMC 对人卵巢癌A2780/DDP 细胞组蛋白/ DNA 碎片含量的影响

2.3 BrMC 对人卵巢癌A2780/DDP 细胞Akt 蛋白磷酸化的影响

Western Blot 分 析 结果表 明，BrMC (5.0、10.0 μmol/L)处理的人卵巢癌A2780/DDP 细胞中p-Akt蛋白表达量明显低于对照组细胞，且呈浓度依赖性下降，而总Akt 蛋白表达水平无明显变化(图3)。

图3 BrMC 对人卵巢癌A2780/DDP 细胞p-Akt 蛋白表达的影响

3 讨论

白杨素是一种具有广泛生物活性的天然黄酮类化合物，但因其在肠道内吸收少，并且5,7 位羟基在体内易迅速与葡萄糖醛酸结合代谢以致活性降低，使其临床应用受到限制[10]，而甲氧烷基的引入能提高其肝脏代谢稳定性和肠道吸收率，从而提高其生物利用度和增强抗肿瘤活性[11]。另外，有研究已经证实ChR 溴代衍生物比先导化合物具有更强的生物活性[12]。8-溴-7-甲氧基白杨素是一种新型白杨素衍生物，比其先导物白杨素有更强的抗实体瘤作用[6]。本研究进一步发现，BrMC 比ChR 更能够有效地诱导人卵巢癌耐药细胞株A2780/DDP 细胞凋亡，PI 染色FCM 分析结果发现，10.0 μmol/L BrMC 作用A2780/DDP 细胞48h 细胞凋亡率为34.8%，而50.0 μmol/L 白杨素诱导的细胞凋亡率仅为21.9%。

Akt 是一种受PIP3 调控的丝氨酸-苏氨酸蛋白酶，与多种细胞的存活信号相关联，一旦被激活，Akt 通过Bad[13]和caspase-9[14]等底物磷酸化行使抗凋亡效应，直接调节凋亡机制，或通过人端粒酶催化蛋白亚单位、叉头蛋白转录家族成员和IB 激酶等间接抑制凋亡[15-16]。为了进一步探究BrMC 诱导A2780/DDP 细胞凋亡的分子机制，我们采用Western blot 分别检测A2780/DDP 细胞中p-Akt和Akt蛋白的表达水平。结果显示，BrMC (5.0、10.0μmol/L) 处理的人卵巢癌A2780/DDP 细胞中p-Akt 蛋白表达量明显低于对照组细胞，且呈浓度依赖性下降，而总Akt 蛋白表达水平无明显变化，从而提示BrMC 可能通过抑制Akt 活化诱导人卵巢癌耐药A2780/DDP 细胞凋亡。

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