KCTD10 在上皮型脑膜瘤中表达的初步研究

黄 亮 ，王光伟,，杨俊梅，熊元元，刘志雄，刘运生，任凯群,，何铁勇，向双林，张 健

（1.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013；2.湖南师范大学生命科学院，湖南 长沙 410081；3.中南大学湘雅医院神经外科，湖南 长沙 410008）

KCTD10（potassium channel tetramerisation domain-containing 10）基因定位于人类染色体的12q24.11，有7 个外显子，属于PDIP1 基因家族，该家族基因高度同源，主要包括TNFAIP1、PDIP1和KCTD10 等基因[1]。这些基因可能在TNF-α 信号通路、DNA 合成和细胞凋亡中起到了重要的作用[1-3]。本研究拟通过免疫组织化学的方法，检测KCTD10 在正常脑膜及上皮型脑膜瘤标本中表达水平的差异，为进一步研究其在脑膜瘤发生发展中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本

脑膜瘤标本均为中南大学湘雅医院神经外科肿瘤切除手术标本，在手术之前均未进行任何放疗、化疗及免疫治疗等特殊处理。所有标本均经组织病理学检查，均为上皮细胞型脑膜瘤。取3例来源于中南大学湘雅医院神经外科凸面脑膜瘤患者手术时取出的脑膜组织作正常对照。所有标本均已切除出血、坏死和电灼的组织，生理盐水冲洗干净后，4%多聚甲醛固定。

1.2 主要仪器和试剂

石蜡包埋机、Leica 石蜡切片机、Olympus 光学显微镜、冰箱；KCTD10 抗体购自南京川博公司，免疫组织化学所用二抗和DAB 试剂盒均购自福建迈新公司。

1.3 免疫组化染色

将置于4%的多聚甲醛液中的脑膜瘤标本取出，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度2 μm，然后脱蜡及水化，将切片置于柠檬酸抗原修复液高压修复，用PBS 冲洗切片3 次，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗切片3 次，加一抗（兔抗人KCTD10 抗体）4℃过夜，PBS 冲洗3 次后加1 滴即用型MaxVisionTM 试剂，室温下孵育15 min。PBS 冲洗3 次，加2 滴新鲜配制的DAB 溶液，显微镜下观察3-5 min，终止显色，苏木素复染封片。以一抗稀释溶液代替一抗作阴性对照。

1.4 细胞学观察

KCTD10 蛋白免疫组化阳性染色结果应为细胞浆和（或）细胞膜呈棕黄色或棕褐色着色。随机选取10 个高倍镜视野，参照Lizasa T的方法进行评分，阳性细胞百分比：无表达为0，1%～25%为1，25%～50%为2，超过50%为3；着色强度：无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3，两者分值相加为最后得分：0 分为阴性，2 分为（+），3～4 分为（++），5～6 分为（+++）。

2 结果

KCTD10 免疫组织化学染色结果如图1、2、3所示，KCTD10 蛋白阳性反应为棕黄色颗粒，主要位于胞浆，同时在细胞浆膜也有表达。免疫组织化学染色检测结果显示KCTD10 蛋白在所有上皮型脑膜瘤标本中高表达，4例上皮型脑膜瘤标本中，有1例KCTD10表达的为（+++）（5 分），3例为（++）（4 分）；而在3例正常脑膜标本中都没有检测到KCTD10的表达。

图1.正常脑膜组织中KCTD10的表达（SABC 法，左图×200，右图×400）

图2.上皮型脑膜瘤 阴性对照（SABC 法，左图×200，右图×400）

图3.上皮型脑膜瘤组织中KCTD10的表达（SABC 法，左图×200，右图×400）

3 讨论

脑膜瘤是中枢神经系统常见的一种原发肿瘤，占原发颅内肿瘤的13%～19%[4]。WHO 将脑膜瘤分为三级15 个亚型：其中9 种属Ⅰ级（良性）、3种属Ⅱ级（低度恶性）、3 种为Ⅲ级（恶性）。上皮型脑膜瘤属于Ⅰ级。脑膜瘤的治疗主要是手术切除肿瘤。随着神经外科技术的发展，脑膜瘤手术的全切率已明显提高，但术后复发率较高，且某些特殊部位的脑膜瘤仍无法做到全部切除。因此，亟需从分子生物学水平对脑膜瘤的发生机制深入研究，以便为脑膜瘤的诊断和治疗提供新的方法。脑膜瘤的发生可能与外伤、病毒感染、激素、生长因子等多种因素有关。近年来，关于脑膜瘤生长、转移的因素和机制的研究取得了一些重要的成果，发现了诸如尿激酶型纤维酶原激活物、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、survivin蛋白、VEGF、P53 等与脑膜瘤的恶变、侵袭过程有关[5-6]，但脑膜瘤发生的分子机制仍远未得到阐明，故有必要深入研究其作用机制。

KCTD10 与PDIP1 在氨基酸序列上高度保守，在N 端区域，都有一个BTB/POZ 结构域，而在C 端区域则是PCNA的结合模体[1]。有研究表明，在人肺癌细胞系A549 细胞中，降低KCTD10的表达会抑制细胞的增殖[7]。在大鼠的实验中发现CTD10和PDIP1 都可以受肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）的诱导，都能与PCNA和DNA 聚合酶δ的小亚基有相互作用，能够激活依赖PCNA的DNA聚合酶δ的活性[3]。TNF-α 是一种多效细胞因子，它在细胞凋亡、细胞增殖等许多细胞生理过程中起重要作用[8]。在许多恶性肿瘤细胞中TNF-α 可以诱导细胞的生长抑制，但在某些细胞系中又可以促进成活和繁殖。PCNA 又称周期素，是一种多功能蛋白，通过与其他蛋白因子的相互作用，在DNA 复制、DNA 修复和细胞周期调控等一系列细胞生理过程中发挥着重要的作用。

本研究结果表明，在上皮型脑膜瘤中KCTD10高表达，而在正常的脑膜组织中无表达，这一结果提示KCTD10 在上皮型脑膜瘤的发生中起到了某种作用。有研究表明PCNA 在脑膜瘤中的的表达显著高于正常的脑组织[9]。结合本研究的结果，推测KCTD10 可能是通过PCNA 介导的信号通路在上皮型脑膜瘤的发生中起作用的。

本研究从组织水平初步检测了上皮型脑膜瘤中KCTD10的表达情况，基于以上的研究结果，本课题组拟收集更多的上皮型脑膜瘤标本，进一步确认上皮型脑膜瘤中KCTD10的表达情况，并在其他类型的脑膜瘤标中检测KCTD10的表达情况，结合细胞学实验确认、证实KCTD10 在脑膜瘤发生发展中的作用与具体机制，为脑膜瘤的诊断和治疗提供新的线索。

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