和厚朴酚对人肺小细胞癌N446 细胞增殖与凋亡的影响

黄清松,李红枝,郑 敏

(广东药学院基础学院,广州 510006)

小细胞肺癌是一种恶性程度很高的肿瘤,其特点是生长迅速,早期容易全身转移,发病率较高,流行病学[1]调查显示,小细胞肺癌占全部肺癌的12%～15%。目前,临床上多采用化疗加放疗相结合的方法进行治疗,但用此法治疗其毒副作用大,患者难以坚持。因此,寻找疗效好而毒副作用低的药物是目前肿瘤治疗学方面的主要方向之一。

近年来,有研究[2-3]表明,厚朴根茎皮中的主要有效成分和厚朴酚,对多种恶性肿瘤细胞均具有比较明显的抑制作用。研究和厚朴酚对某些肿瘤细胞的作用,例如人肺小细胞肺癌N446,探讨和厚朴酚对人肺小细胞肺癌N446 细胞的增殖和凋亡的影响,可为和厚朴酚在临床上应用于治疗人肺小细胞肺癌提供实验数据与理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 和厚朴酚,西安天一生物技术有限公司提供,产品批号:20110113,纯度＞99%)。人肺癌细胞株N446 细胞,中国科学院上海细胞生物学研究所提供。RPMI 1640 培养基(GIBCO,USA,每L 含L-谷氨酰胺0.33 mg、10%小牛血清,链霉素100 U、青霉素100 U、pH 7.4);胰蛋白酶(MERCK,USA);分析纯H2O2(镇江市化学试剂厂,批号:20110311);四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma 公司)、二甲基亚砜(DMSO)和小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供),Annexin-V-FITC(PI)双染色试剂(上海美季生物技术有限公司提供)。用二甲基亚砜(DMSO)将和厚朴酚溶解后,再用0.22 μm 尼龙滤膜过滤除菌得到母液,其浓度为100 mg/mL,放入冰箱-20℃冷冻避光保存,临用前以RPMI 1640 培养液稀释至所需浓度,其中的DMSO 浓度≤0.1%。流式细胞仪(BD FACSCalibur,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养液RPMI 1640:pH=7.4,小牛血清含量为10%。人肺小细胞癌N446 细胞在RPMI 1640 中进行培养(条件:37℃、5%CO2的孵育箱)。每隔48 h 换1 次液,以1∶5 的比例进行传代。

1.2.2 N446 细胞增殖抑制率 取对数生长期的N446 细胞,以RPMI 1640 培养液配制成1×105/mL 细胞悬液,每孔200 μL 接种于96 孔板上培养24 h,细胞贴壁后吸除培养液。1)实验组每孔分别加入200 μL不同浓度的和厚朴酚(终质量浓度分别为2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)。2)对照组加等量不含和厚朴酚的RPMI 1640 培养液。每组分别设有6 个复孔,按照上述常规培养方法分别培养24、48、72、96 h 后再进行MTT 实验。实验时每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)后再培养4 h 后,吸除上清液再每孔加150 μL DMSO,振荡10 min,将酶标仪测调至492 nm 处测吸光度(A)值。3)采用MTT 法检测,细胞增殖抑制率=(对照组A 值-实验组A 值)/对照组A 值×100%。

1.2.3 凋亡率的检测 用RPMI 1640 培养液将对数生长期N446 细胞制成1×106/mL 的细胞悬液,每孔1 mL接种于24 孔板上后再培养24 h 后吸去原来的培养液。1)实验组每孔分别加入1 mL不同浓度的和厚朴酚(浓度分别为5、10、20 μg/mL)。2)对照组加入等量的RPMI 1640 培养液。每组均为3 个复孔。培养48 h 后离心收集细胞,用预冷的PBS 洗涤2 次,用结合缓冲液将细胞密度调为1×106/mL 后,取5 mL 至培养管内,加入Annexin-V-FITC 液5 μL、PI 液5 μL,置于冰箱内4℃避光反应30 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 和厚朴酚对N446 细胞增殖的影响 见表1。

表1 和厚朴酚对N446 细胞增殖的影响(吸光度,)%

表1 和厚朴酚对N446 细胞增殖的影响(吸光度,)%

注:与对照组比较,#P ＜0.05,##P ＜0.01。

2.2 不同和厚朴酚质量浓度对N446 细胞凋亡率的影响 见表2。

表2 不同和厚朴酚质量浓度对N446 凋亡率的影响(n=6)

3 讨论

厚朴为木兰科植物,其枝根皮可提取生物活性物质即和厚朴酚,具有多种药理作用[2-3,11-12],尤其是在抗肿瘤方面的作用,由于其有诱导肿瘤细胞的凋亡、促进肿瘤细胞的分化、抑制肿瘤内新生血管的生长和抑制肿瘤细胞的转移等多靶点、多途径的抗肿瘤效应,加上其毒副作用小而倍受国内外关注。国外研究[4-5]显示,和厚朴酚单独或联合应用可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。国内研究[6-10]显示,厚朴酚均具有明显抑制癌瘤细胞的增长和诱导其凋亡的作用,且其引起抑制肿瘤细胞增殖和凋亡的机制与使癌瘤细胞阻滞于G1 期有关,从而使细胞周期失控,导致细胞增殖停止,发生细胞凋亡。

本研究结果显示,和厚朴酚对人小细胞肺癌N446细胞具有明显的抑制作用和诱导其凋亡的作用,从而提示,和厚朴酚对临床上用于治疗小细胞肺癌具有潜在的应用价值。本研究只对和厚朴酚对人小细胞肺癌N446 细胞的增殖和凋亡的影响作了一些初步的探讨,但对和厚朴酚对人小细胞肺癌细胞作用的具体的分子机制仍有待于进一步深入的研究。

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