加味四君子汤对lewis肺癌小鼠缺氧诱导因子-1α基因、CXC型趋化因子受体4基因及D-木糖的影响

李恒楠，包素珍

(浙江中医药大学，杭州 310053)

肺癌发病率和病死率高居各类恶性肿瘤之首，虽然新的靶向药物及手术方式较以前有大幅度提高，但肺癌的5年生存率近20年没有明显改变[1]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子。研究发现HIF-1α主要表达于肺癌细胞胞核及胞浆，呈现明显的异质性，人正常肺组织无HIF-1α的表达，而肺癌组织中HIF-1α呈高表达[2]；CXC型趋化因子受体4(CXCR4)是近年来倍受关注的受体分子，主要表达于粒细胞、淋巴细胞和树突状细胞，在造血生成、器官发育、炎症反应、淋巴细胞移行与归巢及HIV感染中发挥着重要作用[3]。D-木糖广泛用于检测小肠吸收功能。中医药治疗肺癌具有安全、毒副作用少等特点，能够延长患者的生存期及提高其生存质量。本实验旨在探讨加味四君子汤治疗肺癌的机制。

1 实验材料

1.1 动物及瘤株 C57BL/6小鼠30只，雌性，6～8周，体质量(20±2)g,购自浙江中医药大学实验动物中心；小鼠Lewis肺癌瘤株，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物 加味四君子汤组成：生黄芪30 g，制半夏12 g，浙贝母12 g，白花蛇舌草30 g，茯苓15 g，炒白术20 g，党参15 g，炙甘草10 g，共144 g。购自浙江中医药大学中医门诊部。

1.2.1 主要试剂及仪器 dNTP MIXture、M-MLV反转录酶、RNA提取试剂Trizol;Oligo d(T)、SYBR Premix Ex TaqTM购自大连宝生物工程有限公司，D-木糖，试剂盒购自南京建成生物试剂公司；全自动荧光Real-time PCR仪ABI 7500，购自美国ABI公司。

1.2.2 引物设计 HIF-1α上游引物gaggaaatgagagaaatgcttacac，HIF-1α下游引物cacactgaggttggttactgttg，CXCR4上游引物gcagcaggtagcagtgaaac，CXCR4下游引物gggttccttgttggagtcatag，GADPH上游引物tgcaccaccaactgcttag，GADPH下游引物ggatgcagggatgatgttc由大连宝生物工程有限公司合成。

2 实验方法

2.1 模型制备 小鼠模型制备取传代后第13天的C57荷瘤小鼠,脱颈椎处死，以酒精消毒操作部位皮肤，小鼠皮肤下剥取肿瘤组织，置于无菌平皿中；用消毒过的剪刀将肿瘤块剪碎，置于研磨器中加生理盐水轻轻研磨,过滤于200目筛网，制成瘤细胞悬液；显微镜下计数癌细胞数目，生理盐水调整肿瘤细胞浓度为1×107个/ mL；用1 mL注射器取上述悬液0.2 mL注射于小鼠右腋部皮下。

2.2 组别及给药 接种瘤株24 h后把小鼠分成3组，每组10只。A组为正常组;B组为接种瘤株肺癌组;C组为加味四君子汤治疗肺癌组。小鼠等效剂量按《中药药理研究方法学》计算小鼠量为21.624 g/kg进行灌胃，1次/d，14 d，禁食不禁水12 h，第15天脱颈椎处死。

3 结果

3.1 加味四君子汤干预lewis肺癌小鼠后HIF-1αmRNA表达的影响 见表1。

表1 各组肿瘤组织HIF-1α的Ct值及2-ΔΔCt值比较(±s,n=10)

3.2 加味四君子汤干预lewis肺癌小鼠后CXCR4mRNA表达的影响 见表2。

表2 各组肿瘤组织CXCR4的Ct值及2-ΔΔCt值(±s,n=10)

3.3 各组小鼠血清中D-木糖含量比较 见表3。

表3 各组小鼠血清中D-木糖含量比较(±s,n=10)

4 讨论

卫生部在全国范围内开展第3次死因回顾抽样调查，结果显示我国肺癌病死率呈明显增加趋势，已成为癌症致死第一位。而肺癌转移是导致治疗失败、患者死亡的主要原因，研究[4]发现30%的患者在诊断时就已有远处转移，50%～60%在治疗过程中出现远处转移，80%～90%患者死亡是由转移引起的。“万物沉浮于生长之门”，任何事物都离不开外界环境对其作用，肿瘤也不例外。在肿瘤转移过程中,微微境中HIF-1α、CXCR4的作用尤其重要。据研究[4-5]发现，在肺癌等多种肿瘤组织中淋巴结有转移组HlF-lα的表达强度显著高于无淋巴结转移组。Fan等[6]研究发现，肿瘤分期越晚，HIF-1α表达越高，且越是发生转移的肿瘤组织，HIF-1α表达率就越高。另外HIF-lα还可以强力诱导趋化因子受体CXCR4，在转移肿瘤细胞的定向迁移中起到关键作用。苏丽萍等[7]在蛋白水平和mRNA水平检测了CXCR4在临床肺癌组织标本的表达，发现几乎所有肺癌组织(鳞癌、腺癌及类癌等)都有较高水平的CXCR4表达。分子水平的分析显示CXCR4的表达上调通过磷酸酯环已六醇激酶3/PTEN/AKT信号转导途径、缺氧诱导因子(HIF)-1α的激活、最终引起HIF依赖性CXCR4基因的转录调节。本实验发现肺癌组和肺癌健脾组HlF-lα、CXCR4均有显著差异，加味四君子汤由补气方剂四君子汤加味而成，加黄芪增强补气力量，加半夏、浙贝母软坚散结,加白花蛇舌草抗癌。本实验发现通过加味四君子汤干预后HIF-1α、CXCR4mRNA显著下调。

D-木糖吸收水平能客观反映小肠的表面积及其吸收功能[8]。因此，如果以定量木糖口服，在规定时间内测定木糖量，即可了解小肠吸收功能。通过检测血清 D-木糖水平，可确定肺癌导致了小鼠吸收功能下降，然而肺癌健脾组和肺癌组比较,D-木糖没有差异，这可能是用药时间不够有关,还需要进一步研究。D-木糖是反应脾气虚的一个重要指标，以往研究[9-11]发现，“脾气虚”对肺癌发展有重要影响，本实验发现肺癌小鼠D-木糖含量降低，从而导致小鼠消化功能下降。

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