2011至2012年徐汇区致泻性大肠埃希菌病原学监测与流行病学研究

赵雪涛，高 昆，张春华

(上海市徐汇区疾病预防控制中心微生物检验科，上海 200237)

致泻性大肠埃希菌(diagrrheagenic Escherichia coli，DEC)包括致病性大肠埃希菌(entreopathogenic Escherichia coli，EPEC)、产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(enterohoemorrhagic Escherichia coli，EHEC)和聚集性大肠埃希菌(entroaggregative Escherichia coli，EAEC)，是重要的引起腹泻的病原性细菌。近年来国内外的报道还有弥散性聚集大肠埃希菌(dissfuely adheret Escherichia coli，DAEC)、产非洲绿猴肾细胞(Vero)毒素大肠埃希菌[1]。因其致病基因多种多样，病理过程各异，且目前我国大多数的临床微生物实验室针对肠道病原菌的分子检测较不普及，依然沿用传统的分离培养方法，故检出率较低，对于病原菌本身了解不多，对于DEC的流行病学特征了解较为缺乏。本次研究监测2011年6月至2012年5月的徐汇区某医院肠道门诊病例，按照上海市肠道传染病监测方案的要求规范采样，进行DEC的持续监测，以求了解和掌握本区域内DEC的病原学特点和流行病学特征。

材料和方法

一、标本与病例选择

来自于2011年6月至2012年5月的徐汇区某医院肠道门诊病例，按照上海市肠道传染病监测方案的要求规范采样，采样于运送培养基(carrierblair培养基)，24 h内送至实验室初次分离接种。

二、方法

1.细菌接种分离培养 标本直接于SS培养基划线分离，37℃培养20 h后挑取形态为粉红色、发酵乳糖的单个菌落，纯分离接种营养琼脂斜面和LB肉汤培养基，37℃培养8 h后备用。营养琼脂的纯分离用于进行生化反应鉴定。

2.革兰染色 使用珠海贝索的革兰染液。

3.大肠埃希菌属的生化鉴定 使用VITEK COMPACT全自动细菌鉴定仪和革兰阴性菌鉴定卡(GN)鉴定。

4.细菌核酸提取 使用煮沸法。挑取单个欲测试菌落，在含 0.1%Triton X-100、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide，EDTA)的100 μL配制溶液的离心管中悬浮，放入100℃金属浴中5 min，然后用微量离心机于室温以12000×g离心5 min，取上清即可用于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测。

5.PCR反应体系 镁离子浓度为5 mmol/L，上下游引物浓度各为250 nmol/L，探针浓度为150 nmol/L，DNTP 浓度为 0.2 mmol/L，Taq 酶为2 IU，模板 3 μL，用 ddH2O 补足总体积为 30 μL。

6.PCR反应条件 37℃ 2 min，94℃ 3 min;94℃ 10 s，60℃ 40 s，40个循环;在60℃时检测荧光值。

7.DEC各毒力基因引物和探针序列 以premier公司的beacon designer 7.90版本的软件直接获取基因编号序列，用软件选取上下游引物和taqman探针。见表1。

表1 DEC各毒力基因引物和探针序列

8.仪器与试剂 Biorad IQ5荧光定量PCR仪，PCR用引物、探针及 DNTP等试剂均由上海赛百盛生物技术有限公司合成，选用的培养基均来源于上海市疾病预防控制中心培养基室，且所有试剂耗材均在有效期内使用。

三、统计学方法

采用Stata 7.0统计软件进行 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、整体阳性率和各类DEC的阳性率

2011年6月至2012年5月共检测标本834例，其中 EPEC(Eae+和/或 Bfpa+)21株，ETEC(ST+和/或 LT+)55 株，EHEC(Eae+且 VT1+和/或 VT2+)2株，EAEC(AggR+)19株，DAEC(DraaC+)42株，eastA+检出51株，EIEC(Ial+)未检出。见表2、图1。

表2 2011年6月至2012年5月DEC监测整体情况

图1 DEC监测月度阳性分布图

二、年龄分布

ETEC、EPEC和EHEC各年龄组阳性例数无明显差异，EAEC多见于小年龄组，DAEC多见于老年龄组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

三、性别分布

在 ETEC、EPEC+EHEC、EAEC、DAEC、eastA+各类检出阳性病例中，男女性别分布差异无统计学意义(P＜0.05)。见表4。

四、ETEC的阳性月度分布特征

ETEC共检出55株，在各类DEC中检出率居首，在年度的5月至11月均有检出，此后各月均未检出。ETEC明显高发于夏季，有明显的季节性特征。见图2。

表3 DEC检出病例的年龄组分布特征

表4 DEC检出病例的性别差异分布

图2 ETEC(ST+和/或LT+)阳性检出分布图

五、EPEC和EHEC的阳性检出情况与月度分布

EHEC在监测期间共检出2例，呈散发状态，EPEC多见于春末夏初(5、6、7月份)、夏末及秋季(10、11、12、1 月)。见图3。

图3 EPEC和EHEC(Eae+和/或VT1+/VT2+)阳性检出分布图

六、EAEC、DAEC及ETEC的阳性检出月度分布

EAEC共检出19株，DAEC共检出42株，ETEC共检出55株。EAEC呈波动特征，全年几乎都有发生，季节性不明显;DAEA和ETEC具有季节性背行分布特征。见图4。

七、EPEC与EHEC血清型的关联性

EPEC 检出 O55、O26、O111、O128、O157 等多个血清型，而检出的2例EHEC分别为O111和O157。同一血清型别但携带毒力基因的不同是分类差异的原因，这提示某些血清型型别的EPEC可能更容易受噬菌体感染而导致基因整合后携带Vero细胞毒素基因片段。

图4 EAEC、ETEC和DAEC的阳性检出月度分布图

八、eastA+株

在所有的ST+株中都携带有eastA，在EPEC中同时有 eastA+为28.57%(6/21)，EAEC 中同时有eastA+为63.84%(7/19)，DAEC 中同时有 eastA+为38.09%(16/42)。除此之外，仅eastA毒力基因片段阳性检出为6.12%(51/834)，仅次于ETEC。

讨 论

DEC属于最常见的大肠埃希菌的一类，也是引起腹泻的常见病原菌之一。国内对于DEC的检测报道多为突发事件的个案报告[4-6]，作为最易培养和最常见的肠道病原菌之一，却因为形态难以简单识别、分类方法定义不明确、新方法开展不普及而造成国内大多数实验室对于DEC的检测与监测一直未能有效持续的开展，在此基础上对其流行病学规律与特征的研究更无从谈起。

本研究选取了包含最常见分类的各个毒力基因片段设计的探针和引物序列，新增DAEC与eastA的2个比较新的毒力基因片段，对上海市徐汇区的临床肠道门诊腹泻病例进行了1年多的连续性监测，按照不同的统计分类，DEC年度整体的感染率为肠道门诊腹泻病例的9%(EIEC+EPEC+ETEC+EHEC)、12%(含 EAEC)、17%(含EAEC 和DAEC)、23%(含eastA+)，有季节性的变化，夏秋季节较高，冬春季节稍低。在各类别DEC中，ETEC的高峰在夏季的7～9月份;EPEC虽然整体占比不高，但1年中的5～11月份占有一定的比例，若带有VT毒素基因的EHEC致病性更强，造成的症状更严重。

此次监测结果提示我们DEC具有以下几方面的特征:(1)全年阳性率波动(单月阳性率3:14%～23%)的状况下，阳性检出率结构性的特征明显，如ETEC与DAEC的发病时间交替与错峰，在单一型别高发期间(如8～9月份的ETEC和1～2月份DAEC)，其他型别则几乎不检出;(2)本区域内的DAEC加EAEC的感染发病率甚至要超过季节性高峰的ETEC全年发病率，EAEC和 DAEC致病过程为聚集黏附，尤其是DAEC几乎没有主动黏附机制，致病性不强，多数是症状较轻的病例，EAEC整年都有一定比例，但人群分布特征明显，主要是少儿(＜6岁)和老人(＞65岁)，尤其是少儿的比例更高;DAEC高发期为冬季的12～2月份，人群特征主要为老人;(3)在此次的监测中存在大量的单基因eastA+株，eastA原为EAEC的一个非特异性的毒力基因，一般认为其与EAEC和DAEC关系密切，eastA单阳性株的存在究竟是EAEC和DAEC的变异还是普通大肠埃希菌接受了EAEC和DAEC的质粒而获得部分毒力，这值得进一步深入研究。

DEC较常见，其形态与普通大肠埃希菌无异，传统检测仅仅依靠培养加血清凝集的方法，繁琐且低效。随着国外近年来在DEC的分类与鉴别中的进展，血清学定型与分型很难再作为确定分类的依据，在某一个血清型别之下，因为携带的毒力基因的不同也可能被分为不同的EPEC或EHEC，而且由于很多的毒力基因都由大肠埃希菌的质粒携带[7]，质粒的传递会造成原本某一血清型别的大肠埃希菌变为分型意义上的另一类。DEC的致病性以及分类的模糊与其质粒携带的毒力基因的转移和溶原性噬菌体的序列整合有关，如2011年在德国爆发的引起大面积感染的病原O104的血清型[8]，其携带 AggR+质粒，而且 Eae、VT1 和/或 VT2毒力基因阳性，因其引起的症状为溶血性尿毒综合征，而被分类为EHEC，但其携带的AggR+质粒，是EAEC的特异性毒力基因，故而也有将O104称为EHAEC[9]。

近年来国外对于DEC致病性、分类乃至体内、体外的生物学特征和分子生物学致病机制的研究已取得了长足的进步，国内由于没有广泛的、完整的、持续的监测实践作为基础，无论是实验室还是流行病学人员对DEC的流行病学特征、检测手段、分类分型特征、遗传变异等各方面的了解都亟待提高。

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