贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立

倪梦丽，杨 冰，王春德 ，陈颖，孙善华

（1.青岛农业大学 海洋科学与工程学院， 山东青岛 266109；2.青岛出入境检验检疫局，山东青岛 266001；3.青岛机场出入境检验检疫局，山东青岛 266108；4.黑河出入境检验检疫局，黑龙江黑河 164300）

随着我国经济的发展，近年来水产品包括贝类产品的进出口业务大增，其中的鲜活贝类主要经过机场口岸进出口。进出口的鲜活贝类的用途大部分是食用，少部分为种用。鲜活贝类具有易于死亡和腐败变质的特点，这就要求建立简便、快速的病原生物的检测方法，以利于货物快速通关放行。

贝类中的主要病害生物包括病毒、细菌和原生动物等，其中副溶血弧菌与沙门氏菌是最常见的主要贝类病原。副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，在富含浮游生物、微粒和几丁质的环境中能较好生长，广泛存在于多种水产品中[1]。沙门氏菌是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，是常见的人畜共患的肠道致病菌。其广泛分布于自然界中，对人类和动物健康具有极大危害[2]。副溶血弧菌、沙门氏菌等贝类病原生物能够引起严重的食物中毒、感染、动物性传播疾病，它们在水产品中的存在为水产品食品安全带来极大的隐患。因此对于贝类中该两种细菌能够快速、准确、简便的进行检测对于食品安全具有重要意义[3、4]。

目前，传统的检测方法大都通过病原培养、生化反应、血清学实验、分离鉴定等程序。这些程序检验过程复杂、所需仪器繁多、工作量大、周期长，难以达到快速简便的要求，无法形成标准化和自动化的检测体系。随着分子生物学技术的发展，越来越多的贝类病原生物的核苷酸序列被发表出来。利用这些序列信息和PCR技术，为准确、快速、低成本地检测进出口贝类中的病毒、细菌和原生动物等病原生物提供了可能。实际上，所有存在于宿主体内的病原生物的DNA/RNA都可以用常用的DNA/RNA提取方法同宿主的DNA/RNA一起提取出来，且其DNA/RNA的拷贝数与其在宿主体内的含量成正比。因此，只要根据病原生物的基因序列设计合适的引物，就能够用基于荧光定量PCR的技术特异地定量检测出来。

荧光定量PCR技术具有准确、快速、直观[5]等优势，已在贝类病原检测中得到广泛应用。本研究通过设计退火温度相近的引物，将多种病原生物引物在同一个实时荧光定量PCR扩增仪上进行扩增检测，使得检验流程可以标准化、自动化，以达到迅速、直观、准确、简便、低成本的检验鲜活贝类中的病原生物的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

用于本试验的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus As1.1997）、沙门氏菌（Salmonella As1.1552）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、费氏弧菌（vibrio fi scheri）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）均由黄海水产研究所惠赠。

1.1.2 主要试剂

Taq酶、E.coli competent cells DH5α、SYBR Premix Ex Taq均购自宝生物（大连）生物工程公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Ins TAcolne PCR cloning kit购自富酶泰斯生物技术（深圳）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 荧光引物设计与合成

副溶血弧菌荧光引物根据gyrB基因进行设计，沙门氏菌荧光引物根据fi mY基因进行设计，这两种基因都有种内的高度保守性和种间的高度特异性，引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 所用引物序列

1.2.2 标准质粒的构建

对副溶血弧菌gyrB基因、沙门氏菌fi mY基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化含有目的片段的PCR产物，将目的片段连接到pTZ57R/T载体中。将制备好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用质粒小提试剂盒进行回收、纯化，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，利用紫外分光光度计测定重组质粒的浓度并计算出拷贝数。

1.2.3 荧光PCR的反应条件

扩增反应在Roche LightCycler 480 Ⅱ型荧光定量PCR扩增仪上进行。反应体系为20μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，10μM 的gyrB、fi mY上 下 游 引 物 各 0.4μL，DNA模 板2.0μL，ddH2O 7.2μL。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸20s，45个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

1.2.4 标准曲线的建立

将构建好的两种标准质粒分别作为副溶血弧菌和沙门氏菌定量的标准品，用ddH2O对标准品进行10倍比梯度稀释，采用建立的体系进行荧光定量PCR反应，同时每个浓度做3个平行样品，以保证试验的准确性。检测各浓度标准品对应的Ct值，建立质粒拷贝数与Ct值对应关系的标准曲线。

1.2.5 特异性检测

以1.2.3建立的反应体系及反应条件，以灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、费氏弧菌（Vibrio fi scheri）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）等贝类常见病原菌作为阴性对照菌株，以ddH2O作为无模板空白对照，进行荧光定量PCR特异性检测。

1.2.6 重复性检测

分别取副溶血弧菌和沙门氏菌某一浓度的标准质粒在一次试验中重复20次，观察Ct值的标准偏差和变异系数，以此来初步检验该方法的重复性。

1.2.7 检测方法的初步应用

分别取经传统方法检测证实含副溶血弧菌和沙门氏菌的扇贝样品，取出全部组织。称取30g样品匀浆，以细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。以提取的细菌DNA为模板，按照1.2.3建立的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR反应。

图1 FQ-PCR产物电泳结果

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR产物电泳结果

图1为荧光定量PCR产物电泳图片。副溶血弧菌荧光引物的扩增产物的条带大小介于250bp与500bp之间，沙门氏菌荧光引物的扩增产物的条带大小介于100bp与250bp之间，经生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果证明扩增片段与序列完全相符，说明设计的荧光引物能够扩增出特异的电泳条带。

2.2 定量标准曲线的建立

经紫外分光光度计测定后，确定副溶血弧菌重组质粒浓度为 47.67ng/μL，OD260/OD280为1.824，沙门氏菌重组质粒浓度为60 ng/μL，OD260/OD280为1.856，证明该两种重组质粒的纯度都较高。根据阿伏伽德罗常数换算出每μL重组质粒的拷贝量，副溶血弧菌重组质粒为1.53×1011拷贝/μL，沙门氏菌重组质粒为4.89×1011拷贝/μL。

副溶血弧菌标准曲线在1.53×105～1.53×109拷贝/μL之间有较好的线性关系，相关系数R2=0.9998，斜率为3.850，截距为38.012，得出质粒拷贝数（X）与Ct值之间的线性方程为：Ct=-3.850lgX+38.012（图2）。

图2 副溶血弧菌质粒拷贝数与最小循环数（Ct）的标准曲线

沙门氏菌标准曲线在4.89×106～4.89×1010copy/μL之间有较好的线性关系，相关系数R2=0.9999，斜率为3.492，截距为31.397，得出质粒拷贝数（X）与Ct值之间的线性方程为：Ct=-3.492lgX+31.397（图3）。

图3 沙门氏菌质粒拷贝数与最小循环数（ Ct ）的标准曲线

2.3 定量熔解曲线分析

从熔解曲线（图4、图5）可以看出，副溶血弧菌和沙门氏菌均呈现出典型的熔解峰，扩增目的基因的熔点值Tm分别为85.46℃和85.08℃，检测结果为阳性。阴性对照未出现特异性熔解峰，检测结果为阴性。说明该两种荧光引物的特异性均较强，无引物二聚体产生。

图4 副溶血弧菌熔解曲线

图5 沙门氏菌熔解曲线

2.4 特异性检验

以本研究建立的反应体系及反应条件对灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、费氏弧菌（vibrio fischeri）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）4株阴性对照菌株和ddH2O进行荧光定量检测，均未产生S型扩增曲线，Ct值无法读取，为阴性。该结果与传统生化检测方法结果一致。

图6 副溶血弧菌荧光定量PCR20次重复试验结果

2.5 重复性检验

为了初步检验方法的重复性，本研究分别取副溶血弧菌和沙门氏菌某一浓度的标准质粒在一次试验中重复20次。结果表明，副溶血弧菌重组质粒的扩增曲线在阈值线附近基本上重合（图6），Ct值平均读数为27.47，标准偏差为0.31，变异系数为1.15%。沙门氏菌重组质粒的扩增曲线在阈值线附近也是基本上重合的（图7），Ct值平均读数为23.79，标准偏差为0.32，变异系数为1.34%。以上统计结果表明，本研究所建立的副溶血弧菌和沙门氏菌双重荧光定量PCR快速检测方法重复性好。

图7 沙门氏菌荧光定量PCR20次重复试验结果

2.6 检测方法的实测检验

对扇贝样品的实测结果，测得副溶血弧菌阳性扇贝样品Ct值为22.37，由标准曲线计算得其拷贝量应为1.53×106拷贝/μL，与MPN培养检测法测得1.49×106拷贝/μL接近；测得沙门氏菌阳性扇贝样品Ct值为20.97，由标准曲线计算得其拷贝量应为4.89×106拷贝/μL，与MPN培养检测法测得4.81×106拷贝/μL接近，说明该研究方法可以满足水产品中副溶血弧菌和沙门氏菌的快速检测。

3 讨论

贝类中存在的病原生物种类繁多，国际上针对不同类别的病原生物的检测通常需要用不同的方法。例如病毒和细菌的检测通常需要通过培养的方法，而原生动物的检测很多通过电镜观察、组织病理学方法和基于抗原抗体反应的免疫学方法，需要分别建立不同的方法和实验条件，实验过程繁琐，时间长，因此无法做到快速检测和检测标准化、自动化的要求。随着PCR技术的问世，基于该技术的检测方法逐渐被应用到病原生物的检测上，例如早在上世纪九十年代初Ward et al.[6]即开始用PCR方法检测节肢动物传播的病毒。迄今为止PCR技术在国际上已经成为主要的水产动物中病原生物检测方法。

在贝类中，PCR方法已广泛用于各种病原的检测。

虽然所有基于PCR技术的基本原理相同，但在PCR产物检测技术上不断改进。早期的PCR产物检测方法主要是通过凝胶电泳根据产物的大小和测序来判定所扩增的是否为预期的产物，以后通过DNA杂交技术进一步改进了产物的检测方法，例如可以用点杂交和原位杂交来显示与标记的DNA探针杂交的PCR产物，显色的方法则主要包括染色法和荧光法，这些方法既可以用来定性研究也可以定量研究病原生物的存在。随着荧光PCR方法的出现，人们可以直接将荧光染料掺入到PCR产物中，使实时定量检测PCR产物成为可能。

近年来，荧光定量PCR技术已越来越多的应用于致病菌的检测中[7-9]，我国用PCR技术检测水产动物中病原生物始于90年代中后期，在贝类中已用于检测甲肝病毒[10]、轮状病毒[11]和诺瓦克病毒[12]和栉孔扇贝中的急性坏死病毒[13]等病毒类病原体，副溶血弧菌[14]等细菌性病原体，以及单孢子虫、派琴虫、马尔太虫[15]等原生动物类病原体。以往多为单一PCR，每次只能检测一种病原生物，若要同时检测贝类中的主要病原生物则费时费力，不适用于水产品尤其是鲜活贝类快速通关的要求。目前，国内针对贝类主要病原副溶血弧菌和沙门氏菌同时进行荧光定量检测方法的研究还很少，本研究采用了根据副溶血弧菌gyrB基因、沙门氏菌fi mY基因设计的特异荧光引物进行荧光定量PCR检测，结果表明，在不同的DNA浓度中，副溶血弧菌gyrB基因和沙门氏菌fi mY扩增稳定。

但是，该方法也存在一定的局限性。当样本中细菌拷贝量很低时，双重荧光定量PCR检测虽有扩增曲线产生，但不易明确判断。因此，在基线、阈值一定时，对于Ct值大于30的样品，应重新进行实验或采用其他传统方法予以确证。

该方法操作简便快捷，能在1.5h内同时完成贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌的检测，根据本文的结果，未来可搜集所有已经发表的贝类中病原生物核酸序列，设计引物，优化产物检测手段，建立贝类主要病原检测数据库。该数据库不仅可以提供高通量的、快捷、简便、准确的贝类病原生物检测方法，同时检测不同类别的病原生物，达到快速检测保证水产品迅速通关的目的；还可为贝类重大疾病的预警预报和防治技术提供基础材料。

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