马媾疫锥虫PCR检测方法的研究

郑小龙，王 群，朱来华，邓明俊，肖西志，梁成珠，姜 帆，于业锋

（山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002）

马媾疫（Dourine）是由锥虫属（Trypanosoma）的马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）寄生于马属动物的生殖器官所引起一种寄生虫性传染病[1]。马媾疫是唯一不以无脊椎动物为媒介而直接传播的锥虫病[2]，主要通过病马与健马交配传染[3]。

我国与俄罗斯、韩国、蒙古等国家签订的双边协议书中将马媾疫列为进出境马属动物必检疫病之一，也是OIE须申报疫病。目前，国内该病的检测主要通过血清学和病原学两种方法。血清学方法包括ELISA[4-5]、间接免疫荧光[6]和补体结合试验[2]，国内外尚未有成熟的商品化的ELISA和间接免疫荧光试剂盒，而补体结合试验操作繁琐，影响因素过多，结果判定比较困难；而病原学检测国内一直采用血涂片方法[3]，由于马媾疫锥虫主要存在于组织中，很少侵入血液[2]，因此该方法检出率很低。

PCR检测方法以其操作简便、快速特异、灵敏度高等特点，展示出了优越的应用前景。Moser等[7]首先建立了PCR技术在锥虫病上的检测，克服了之前核酸杂交诊断法的敏感性受限制的不足。在我国，王云飞等[8]最早用PCR技术来诊断伊氏锥虫病，而对于马媾疫锥虫PCR检测方法的研究较少。本研究利用锥虫基因组中存在的差异[9-10]，依据马媾疫锥虫大环kDNA基因的一段序列设计引物，建立了一种特异、快速的检测马媾疫锥虫的PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株 马 媾疫锥虫基因组、伊氏锥虫基因组和马焦虫基因组由本实验室保存。

1.1.2 试剂 Taq DNA polymerase （5 U/μL）、dNTP（ 各 2.5 mmol/L）、DNA分子量标准（DL2000）、DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 引物设计 根据GenBank 登录的马媾疫锥虫Maxicircle DNA 基因序列，选择保守区域，利用DNAstar软件设计一对PCR的引物。D1：5’-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTAT-3’和D2：5’-CCCTAATAATCTCATCCGCAGT-3’，扩增长度为395bp，由南京金斯瑞合成。

1.2 方法

1.2.1 马媾疫锥虫基因特异性保守片段的扩增 以马媾疫锥虫基因组为模板，采用上述引物进行PCR扩增。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃10 min。反应完毕，取5μL扩增产物，经1%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像系统观察记录结果。

1.2.2 PCR的灵敏性检验 将马媾疫锥虫DNA于核酸蛋白检测仪测定其含量，以2 ng/μL为起始浓度进行10倍梯度稀释，6个梯度浓度分别为2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL、0.2 pg/μL、20 fg/μL，然后同 1.2.1进行 PCR 扩增，以检测其敏感性。

1.2.3 PCR的特异性检验 利用引物对马媾疫锥虫、伊氏锥虫、马焦虫的基因组进行PCR扩增，于1.0%琼脂糖凝胶上电泳，以检测其特异性。

2 结果

2.1 PCR检测方法的建立

以马媾疫锥虫基因组为模板，以引物D1和D2进行PCR扩增，结果能扩增出与预期一致的特异性DNA片段（约395bp）（图1）。进一步切胶回收DNA测序，并进行序列分析，确证两条特异性引物间的序列为马媾疫锥虫kDNA片段序列。

2.2 PCR检测方法的灵敏性试验结果

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

将马媾疫锥虫DNA进行10倍梯度稀释，用引物D1和D2进行PCR扩增。6个浓度梯度的PCR结果显示，本研究建立的PCR方法能够检 测 出 2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL和0.2 pg/μL的马媾疫锥虫总DNA，最低可检测到0.2 pg/μL DNA，具有较高的敏感性（图2）。

图2 PCR灵敏性试验结果

2.3 PCR反应的特异性试验结果

用引物D1和D2对马媾疫锥虫、马伊氏锥虫和马焦虫的DNA进行PCR扩增，结果显示，马媾疫锥虫DNA样本能够扩增出与预期大小（395bp）相吻合的特异DNA条带，而对马伊氏锥虫和马焦虫的核酸样品均不能扩增出特异性条带，呈阴性反应（图3）。

3 讨论

图3 PCR特异性试验结果

PCR技术是由美国Mullis K B等人于1985年建立，并在后来不断发展并完善的一种人工体外DNA扩增技术。该技术能快速、特异地在体外扩增特定的DNA片断，使之在短时间（数小时）内特异地扩增数百万倍。目前，该技术已经广泛的应用于细菌、病毒病的研究和诊断。

锥虫含动基体目原虫特有的非染色体动基体DNA（kDNA），国际上首先发展的用于检测锥虫的分子探针，主要是以锥虫动基体DNA（即kDNA）为目标。kDNA是由少数大环和大量微环组成的网状分子。感染马的锥虫主要为马媾疫锥虫和马伊氏锥虫，而马伊氏锥虫的动基体DNA缺乏大环而由微环组成，因此本文选择动基体DNA大环作为检测和鉴定马媾疫锥虫的靶DNA，从而可以区分马媾疫锥虫和马伊氏锥虫。

本文通过对不同温度PCR条件进行摸索，最终确定了最佳退火温度为56℃。本试验的灵敏度试验结果显示，本方法对马媾疫锥虫DNA的最低检测量为0.2pg/μL，灵敏度较高。特异性试验结果显示，设计的PCR引物能够扩增出马媾疫锥虫395bp的目的片段，而对马伊氏锥虫和马焦虫均无扩增产物，从而证明本实验具有良好的特异性。

本方法的建立为马媾疫锥虫的诊断又增加了一个重要的检测手段，而且克服了传统病原学诊断方法费时费力，检出率低等缺点。该方法快速、敏感、特异，有着良好的应用前景。

[1]王群，郑小龙，朱来华，等.马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34（9）：724-727.

[2]World Organization for Animal Health （OIE）.Dourine [M]//Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.6thed Paris， France： OIE， 2008.

[3]王玉玲.马媾疫微量补体结合的改良试验[J].中国动物检疫，2003， 20（6）：23-25.

[4]Wassall D A， Gregory R J F， Phipps L P.Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）for the serodiagnosis of dourine[J].Vet Parasitol.， 1991， 39（3/4）：233-239.

[5]Working Protocols， BGVV： ELISA on Dourine （1995）.Bundesinstitut fur Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin （BgVV）.P.O.Box 33 00 13， D-14191 Berlin，Germany.

[6]MINISTRY OF AGRICULTURE， FISHERIES AND FOOD （1986）.A Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques， 3rd ed.Her Majesty’s Stationery Office，London， UK.

[7]Moser D R，Cook C A，Ocks D E．Detection of Trypanosoma congolense and Trypanosoma brucei subspecies DNA ampli fi cation using polymerase chain reaction[J].Parasitology，1989， 99（1）： 57-56.

[8]王云飞， 周勇志， 淑梅.应用PCR扩增检测伊氏锥虫的研究[J].畜牧兽医学报， 1998，29（2）：168-173.

[9]Li Fengjun， Gasser R B， Lai Dehua， et al.PCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and T.equiperdum and their differentiation from T.evansi based on maxicircle kinetoplast DNA[J].Mol Cell Probes，2007，21（1）：1-7.

[10]Claes F， Radwanska M， Urakawa T， et al.Variable surface gly-coprotein RoTat 1.2 PCR as a speci fi c diagnostic tool for thedetection of Trypanosoma evansi infections[J].Kinetoplastid Biol Dis，2004，3（1）：3.