夹脊电针对脊髓损伤大鼠内质网应激相关因子IRE1影响的实验研究

唐祎周，孙忠人，张 翀

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是常见的中枢神经系统损伤。大量研究表明SCI后的继发性损伤才是导致其功能障碍的主要原因。继发性损伤早期具有可逆性［1］，后期则造成脊髓功能永久性丧失。细胞凋亡(apoptosis)是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。死亡受体活化和线粒体损伤途径是细胞内两条经典的凋亡途径［2］，内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可诱导未折叠蛋白反应，其感受器为 Irel蛋白［3］。本研究通过观察脊髓损伤后细胞凋亡情况及损伤处IRE1蛋白表达的变化，探讨电针对内质网应激介导的细胞凋亡的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠132只，体重(200±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。使用随机数字表随机分为假手术组、模型组、对照组、疏波组4组，每组分为8 h、3 d、7 d三个时相点，每个时相点11只。分笼饲养，室温保持在(22±2)℃，自由饮水进食，适应环境，保持正常的12 h白天和黑夜交替周期。

1.2 主要仪器和试剂

手术显微镜(四川科奥达)、moticam3000显微摄影成像系统(美国)、Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination(Sigma)SDS－PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime)、RNA 反转录试剂盒(Takara，日本)、Irea－1抗体(ADCAM，美国)。

1.3 动物模型的制备

大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)经腹腔进行麻醉，固定后备皮，常规消毒，以胸8棘突为中心，沿脊柱方向取一长约3.0 cm的切口，切开皮肤、肌肉，分离并显露棘突，游离附着于棘突两侧的骶棘肌，将胸8棘突椎板全部切除，保留硬脊膜。用改良式Allen's WD装置，以脊髓后正中血管为中心，采用5 g冲击棒自10 cm高度垂直自由下落击打于脊髓背侧圆形薄铜垫片(直径 0.3 cm，重 0.001 g)上，打击面积约7.00 mm2，打击力度约为0.05 N。造模成功的标志:下落撞击后，见鼠尾痉挛性摆动、双下肢及躯体回缩扑动后，双下肢瘫痪，标志撞击成功。术后将大鼠饲养于保持在(22±2)℃室温，相对温度60% ～80%环境中正常喂养。各组于术后1 h给予腹腔注射2万μ/kg青霉素，每日两次，持续3日。各组于术后每日3次进行膀胱区按压排尿，防止尿潴留及泌尿系感染。

1.4 干预方法

1.4.1 假手术组 只做椎板切除，不造成脊髓损伤。

1.4.2 模型组 脊髓Allen's打击损伤后腹腔注射给予与对照组组等量生理盐水，持续1周。

1.4.3 对照组 脊髓Allen's打击损伤后30 min内首次按30 mg/kg腹腔注射甲基强的松龙，随后按5.4 mg/kg/h给药，每1 h给药一次，连续给23次。

1.4.4 疏波组(夹脊电针疏波治疗组) 脊髓Allen's打击损伤后立即采用电针治疗，每日1次，每针刺6 d，休息1 d，持续1周。电针采用KWD－808II型脉冲电针仪，频率2 Hz;输出强度以背部肌肉出现轻微抽动为度。部位及操作参照《实验针灸学》(中国中医药出版社出版)，大鼠穴位在损伤区上、下端的棘突间隙旁开距中线3～4 mm处取穴;操作:将6 mm华佗牌毫针(0.30 mm)垂直刺入约4～5 mm，使针尖触及椎板，电极分别连接上下针柄，持续30 min，每日1次，针刺6 d，休息 1 d。

1.5 指标的检测

1.5.1 TUNEL法检测损伤处细胞凋亡 参照TUNEL凋亡试剂盒说明书，将石蜡切片常规脱蜡至水。滴加胃蛋白酶K(20μg/ml溶于10 mM的Tris/HCL中，PH值7.4～8.0)室温(22 ±2)℃孵育 30 min，PBS冲洗 2次。擦干样品周围的水，滴加50 μl的Tunel反应混合液，孵育60 min，PBS冲洗3次。拭出水分，加入50 μl的转化剂－POD，孵育30 min，PBS冲洗3次。滴加显色剂DAB，室温下10 min使其显色，再用蒸馏水充分冲洗，苏木素复染1 min。常规脱水透明后，用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.5.2 Western blot检测Ire－l蛋白表达 于各时间点麻醉动物后迅速取出脊髓，用细胞裂解液提取蛋白，SDS－PAGE电泳分离蛋白，转膜，漂洗。用滤纸吸尽洗涤液，加入封闭液，4℃封闭过夜。一抗(1∶200兔抗鼠Irel，内参为1∶50兔抗鼠13－actin)孵育，参考一抗的说明书，按照适当比例用Western－抗稀释液稀释一抗。37℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10 min，共洗涤3次。二抗(1∶200HRP标记羊抗兔IgG)孵育，参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。加入稀释好的二抗，37℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h，洗涤3次。用DAB试剂盒显色，直至显色至预期深浅后，去除DAB染色工作液。用滤纸将膜吸干，避光放置20 min后，将膜置于扫描仪中扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.6 统计方法

应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，实验数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素ANOVA等分析，若方差不齐，再用Duncan检验，P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL检测细胞凋亡

Tunnel染色显示，光镜下观察假手术组脊髓神经细胞，着色的细胞数量少，且数量与时间变化无关。模型组于各时相点均出现神经元和神经胶质细胞的凋亡，具有典型的细胞凋亡特征性改变，细胞体积缩小，凋亡细胞胞质浓缩，细胞核染色质固缩，呈斑块状聚集于核膜周围，细胞膜内陷形成凋亡小体。8 h时相点主要见于脊髓灰质后角细胞凋亡现象阳性，3 d时相点均出现在灰质和白质凋亡细胞阳性，7 d时相点灰质的阳性细胞减少，凋亡阳性细胞主要出现在白质中。脊髓损伤后8 h、3 d、7 d，其前角可见散在的凋亡神经元和神经胶质细胞，并呈逐渐增多趋势。疏波组及对照组同模型组相比，神经元的损伤明显减轻，说明电针治疗对脊髓的神经元有保护作用，并具有抗凋亡作用。见图1。

2.2 夹脊电针对脊髓损伤大鼠IRE1的蛋白表达的影响

表1 SCI大鼠Ire－1不同时段各组平均光密度值比较

图1 SCI大鼠7 d细胞凋亡情况

IRE1蛋白的表达将Western blot检测结果与标准蛋白分子量比较，结果表明脊髓损伤造模后模型组8 h、3 d、7 d三个时相点IRE1蛋白表达均明显上调，假手术组表达较少，差异有统计学意义(P＜0.01)。各时间点，模型组与对照组、疏波组比较，IRE1蛋白表达均有显著性差异;对照组与疏波组比较，IRE1蛋白表达均有显著性差异;且各时间点对照组数值均高于疏波组。见表1。

3 讨论

继发性脊髓损伤(sequential spinal cord injury，SSCI)通过一系列的生化反应加重神经元的变性坏死或凋亡，严重损伤残存神经细胞［4］。细胞凋亡是继发性脊髓损伤进行性加重、神经元细胞发生不可逆改变的重要作用机制［5］。细胞内线粒体和细胞外死亡受体相关的两条途径是以往关于细胞凋亡机制的主要研究方向。而最近几年的相关研究表明除这两条途径外，还存在内质网应激细胞凋亡信号的转导途径。内质网是合成脂类蛋和白质的主要细胞器，同时指导蛋白质的正确折叠和糖基化，并兼有储存和维持胞内钙离子的动态平衡功能。细胞急、慢性损伤改变了内质网工作环境，使其蛋白质的正确折叠和糖基化受到阻碍，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔不断堆积，引起内质网的功能紊乱。而紊乱达到一定程度后，将诱发一种可协助蛋白质正确折叠的伴侣蛋白的表达，继而引起内质网未折叠蛋白反应。如果未折叠蛋白反应在时间或强度上达到相应的水平则会促诱发内质网应激，从而激活凋亡酶Caspase－12的大量表达，最终导致细胞凋亡。

内质网应激反应中，首先被激活的是内质网膜上的跨膜感受蛋白激酶 IRE1、Perk、和 Atf6，其中 IRE1和Perk是未折叠蛋白反应近端感受器。IRE1能通过某种机制检测到未折叠蛋白的聚集，因此被认为是内质网中未折叠蛋白感受器。活化的IRE1具有核酸内切酶活性，可特异性剪切转录因子XBP－1mRNA抑制序列，高效翻译XBP－1蛋白，该蛋白促使伴侣蛋白Bip/GRP78基因表达上调，伴侣蛋白翻译增加，从而引导蛋白质正确折叠［6］。IRE1能够利用酵母双杂交介导ERS相关的促凋亡和抗凋亡信号，在内质网应激早期，PERK和ATF6被激活以拮抗ERS，IRE1一旦被激活，首先通过剪接 XBP－1诱导 UPR，随后诱导P58IPK的表达恢复蛋白质合成，使细胞恢复到正常状态。但如果应激继续加重，IRE1就会通过激活JNK激酶诱发细胞凋亡［7］。IRE1作为内质网应激反应起始阶段的感受蛋白，其表达水平的变化，在一定程度上反映了UPR和ERS的程度。

甲基强的松龙是一种合成的中效糖皮质激素，是目前治疗脊髓损伤的“金标准”。既往研究结果表明用大剂量甲基强的松龙在伤后8 h内，首先以30 mg/kg静脉内快速冲击，继之以5.4 mg/(kg.h)维持23 h，可明显改善患者运动和感觉功能。但受损8 h后，即使继续给药也不能逆转损伤神经元的变性［8］。甲基强的松龙阻止继发性脊髓损伤发生的可能机制主要是:①逆转细胞内钙离子聚集;②增加钠和钾离子依赖性ATP酶的活性;③抑制炎症反应;④减轻水肿;⑤抑制血管活性、前列腺素活性，增加脊髓血流量;⑥抑制氧自由基及脂质过氧化反应，稳定细胞膜和溶酶体膜［9］。本实验还发现，脊髓损伤后甲基强的松龙能够降低内质网应激相关凋亡因子IRE1蛋白的表达，提示甲基强的松龙能够拮抗内质网应激介导的细胞凋亡，但其通过怎样的具体机制作用于内质网，抑制内质网应激的发生尚不清楚。

本研究中笔者也发现凋亡细胞在空间和时相分布上也有特定的规律，空间上特征:①损伤区域附近有更多凋亡细胞，凋亡细胞数量远远高于原发损伤段;②凋亡细胞多以胶质细胞为主，根据细胞的形态和分布区域分析，大多数为少突胶质细胞;③白质中的凋亡细胞数量多于灰质。时相分布的特征主要为:①胶质细胞在相对较长时间内陆续凋亡，而神经元则相对较早发生凋亡;②细胞凋亡现象在伤后8 h即可在损伤段被发现。笔者发现电针及甲基强的松龙治疗组凋亡细胞数较模型组少，提示电针和甲基强的松龙可能是通过抑制细胞凋亡而发挥神经保护作用，减轻脊髓损伤所致的神经功能的缺失。有学者［3］研究发现，脊髓损伤后第1 d、3 d、7 d、14 d在灰质均可见 IRE1阳性细胞数和染色强度逐渐增高，并于术后14 d达锋值，术后21 d、28 d下降较明显。目前本实验只探究37天内细胞凋亡组织形态学以及IRE1蛋白的表达情况，而进一步探究针刺对于脊髓损伤后14 d及更长时间的作用情况是笔者未来研究的方向之一。

本研究基于内质网应激细胞凋亡探讨夹脊电针的相关机制。在脊髓损伤后应用夹脊电针治疗，内质网应激相关因子IRE1的蛋白表达水平与模型组比较均不同程度降低，其作用优于甲基强的松龙。结果表明，电针通过降低内质网应激凋亡因子，升高抗凋亡因子，抑制内质网应激细胞凋亡。

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