穴位埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠Toll样受体4和核因子－κB表达的影响*

陈 璐，李素荷，钟国新，樊永磊，张 璇，黄志毅

(广州中医药大学，广东广州 510405)

慢性萎缩性胃炎(CAG)是指不同病因引起的慢性胃黏膜萎缩性病变。Toll样受体(TLR)是一种跨膜受体蛋白，通过识别细菌、真菌、细胞坏死成分等内源性或外源性配体，参与炎症反应并促进和提高免疫应答［1］。研究已证实在胃黏膜感染Hp后，TLR4表达增加，从而使核因子－κB(NF－κB)活化，而过强的免疫反应是炎症发生的重要机制之一［2］。NF－κB是一类与DNA结合的二聚体蛋白，为细胞内重要的转录调控因子［3］。NF－κB激活后转位至细胞核内，通过与DNA相结合启动并调节炎症反应相关基因转录。TLR4/NF－κB信号介导了胃部疾病的炎症反应过程。本实验旨在探讨穴位埋线对TLR4/NF－κB信号传导通路的影响，从而更好地指导临床实践。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

60只SPF级8周龄SD大鼠(由广东省医学实验动物中心提供，许可证号:SCXK粤2008－0002)，雌雄各半，体重180～220 g，采用架式笼养，恒温(20±1)℃，湿度50% ～60%，光照黑暗各12 h交替，自动通风8～15次/h条件下饲养。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组、模型组、自然恢复组、埋线组，每组15只。

1.2 主要试剂及器械

试剂:甲基－硝基－亚硝基胍(MNNG，生产批号:GNGMH日本东京化成工业株式会社)，兔抗鼠TLR4多克隆抗体 (生产批号:BA0299，美国Abcame)，兔抗鼠NF－κB多克隆抗体(生产批号:BA0614，美国Abcame)，SP试剂盒(生产批号:C0103，武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色试剂盒(生产批号:ARl012，武汉博士德生物工程有限公司)，10%中性缓冲福尔马林固定液(生产批号11011301，广州维格斯生物科技有限公司)。器械:①针具:6号一次性注射针头(浙江京环医疗用品有限公司生产)，华佗牌30号1.5寸不锈钢毫针(苏州医疗用品厂);②埋植用羊肠线:0000号铬制羊肠线(上海浦东金环医疗用品有限公司)。

1.3 模型复制与治疗

正常对照组普通饲料正常喂养。除正常对照组外，其余各组于普通饲料喂养1周后，采用自由饮用100 mg/L甲基－硝基－亚硝基胍(MNNG)配合饥饱失常法复制大鼠CAG模型［4－6］。将MNNG用蒸馏水配制成1 g/L浓度的储存液，4℃冰箱避光冷藏保存，每周配制1次，用时将储存液配成100 mg/L浓度的饮用液，装入包裹锡纸的饮水瓶中，每天更换，让大鼠自由饮用，同时配合饥饱失常，连续造模12周。于第12周末，各组随机抽取2只大鼠处死，取胃，行病理检查，判断模型成功与否。CAG的病理诊断标准参照文献制定［7］:固有腺体萎缩;黏膜肌层增厚;可有肠上皮化生或假幽门腺上化生;固有膜炎症;可有淋巴滤泡形成。

造模成功后将正常对照组、模型组大鼠处死，取材固定;自然恢复组大鼠普通饲料正常喂养，只抓取不治疗;埋线组选取大鼠“足三里”、“中脘”、“脾俞”穴埋线治疗［8］。操作:定位后使用弯剪、脱毛露先行脱毛，毛脱尽后用生理盐水擦拭脱毛部位，以减少脱毛露对大鼠皮肤的刺激。准备完毕后，穴位用2.5%的碘酒消毒，75%的酒精脱碘。将0.5 cm长的0000号羊肠线从6号注射针头的针尖处装入针体，此时注射针头内作为针芯的30号1.5寸不锈钢毫针稍退后，线头与针尖内缘齐平，背腰部穴位在局部下方向上平刺、腹部斜刺、下肢穴位直刺，刺至所需深度，边推针芯，边退针管，将羊肠线埋植于穴位皮下组织或肌层内，线头不外露，消毒针孔。每周治疗1次，共治疗8周。

1.4 指标检测与方法

1.4.1 胃黏膜组织病理学观察 实验结束后，大鼠禁食、禁水24 h，乙醚吸入麻醉，剖腹，距贲门和幽门1.5 cm离断取出全胃并处死。沿胃大弯侧剖开，冰生理盐水冲洗后，滤纸吸干铺开，固定于10%中性甲醛，常规取材，石蜡包埋，包埋组织进行连续切片，切片厚4～5 μm，苏木素－伊红染色(HE染色)，置光镜下观察，并进行显微摄影。

1.4.2 免疫组化法检测TLR4和NF－κB表达 实验结束后，大鼠胃黏膜组织进行石蜡包埋，包埋组织进行连续切片，切片厚4～5 μm，附于多聚赖氨酸包被的载玻片备用。切片经常规脱蜡、水化、微波抗原修复后，按试剂盒说明书以SP法进行免疫组织化学染色，DAB显色，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，检测TLR4和NF－κB的表达。显微镜下，细胞质和/或细胞核呈棕黄色或棕褐色着染为阳性细胞。Olympus病理图像采集系统400倍光镜下每张切片随机选取5个视野拍照，使用MIAS医学图像分析管理系统进行光密度分析，并计算平均光密度值(OD值)。

1.4.3 胃黏膜超微结构观察 实验结束后，大鼠取出全胃并处死。沿胃大弯侧剖开，于胃小弯处快速取约0.1 cm ×0.1 cm ×0.5 cm 的组织(包括胃窦及部分胃体)投入30 g/L戊二醛固定，缓冲液洗涤后再经10 g/L四氧化锇4℃后固定1 h，双蒸水漂洗，逐级丙酮脱水，环氧丙烷置换，Epon12包埋。聚合过程:37℃，12 h;45℃，24 h;60℃，24 h。聚合完成后，做超薄切片，甲苯胺蓝染色，JEM－1200EX透射电镜下观察并记录结果。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为统计学有意义。

2 结果

2.1 大鼠胃黏膜组织病理改变

由封三彩图1可见，A正常对照组:胃黏膜层厚度大，上皮细胞及腺体排列整齐，大小形状一致，细胞呈单层柱状，胞质透明或空泡状，腺体丰富与胃小凹分界清晰，固有腺及粘膜无充血、水肿，黏膜肌层无增生;B模型组:胃黏膜层变薄，肌层增宽，胃小凹变浅，腺体变小，排列紊乱，数量减少，并有囊性扩张，间质有纤维组织增生及淋巴细胞浸润，可见肠上皮化生现象;C自然恢复组:胃黏膜层变薄，固有膜内有淋巴细胞、浆细胞浸润，肌层增宽，胃小凹变浅，腺体排列紊乱，腺体大小不规则，可见明显囊性扩张，腺体数目减少;D埋线组:胃黏膜层无明显变薄，胃小凹之间的固有膜内，可见少量浆细胞、淋巴细胞浸润，肌层无增宽，腺体排列整齐，腺体大小稍不规则，数量未见明显减少，但部分腺体可见囊性扩张。

2.2 大鼠胃黏膜组织中TLR4和NF－κB的免疫组化表达情况

各组免疫组化染色阳性细胞(棕褐色)见封三彩图2、3。TLR4和NF－κB均呈现正常对照组低表达，模型组和自然恢复组高表达，埋线组中度表达。

半定量统计目标蛋白表达量(平均光密度)见表1。各组TLR4表达水平，模型组和自然恢复组均明显高于正常对照组(P＜0.01)，自然恢复组与模型组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，埋线组较模型组表达减少(P＜0.05)，埋线组与自然恢复组比较表达减少(P＜0.05)。各组NF－κB表达水平，模型组和自然恢复组均明显高于正常对照组(P＜0.01)，自然恢复组与模型组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，埋线组明显低于模型组(P＜0.01)，埋线组与自然恢复组比较表达减少(P＜0.05)。

表1 各组TLR4、NF－κB表达平均光密度比较(±s)

表1 各组TLR4、NF－κB表达平均光密度比较(±s)

注:与正常对照组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＞0.05;与模型组比较，cP ＜0.05，dP ＜0.01;eP ＜0.05。

组别 n TLR4/(OD·μm－2) NF－κB/(OD·μm－2)正常对照组13 0.048 ±0.014 0.057 ±0.022模型组 13 0.213 ±0.019a 0.199 ±0.024a自然恢复组 13 0.196 ±0.010ab 0.183 ±0，010ab埋线组 13 0.145 ±0.012ace 0.120 ±0.017ade

2.3 大鼠胃黏膜组织超微结构改变

由封三彩图4可见，正常对照组:A1:壁细胞在胃底腺的腺颈部及腺体上半部较多，细胞较大，核呈卵圆形，细胞胞质内可见分泌小管，小管直径约1～2 μm，表面有许多微绒毛，小管与胃底腺管腔相通，当壁细胞分泌盐酸时，分泌小管管径增大，静止期壁细胞分泌小管往往缩小以至闭塞，但见微管泡增多，此外壁细胞内有丰富的线粒体，线粒体呈圆形或长方形。嵴密呈板层状，胞质内还可见少量溶酶体等;A2:主细胞又称酶原细胞，主要分布于胃腺的基底部及体部，细胞核位于基部，胞质内可见粗面内质网，少量线粒体和许多有界膜的酶原颗粒，酶原颗粒以胞吐的形式分泌蛋白酶至腺腔。模型组:B1:壁细胞可见轻度核固缩，细胞内分泌小管扩张，微绒毛突起退变，线粒体数量减少，而且线粒体的结构有明显的损伤，其主要表现为线粒体肿胀，膜缺损，嵴断裂、基质变淡等;B2:主细胞核仁萎缩，染色不均匀，核膜扩张迂曲，有深浅不等的凹陷，胞质稀疏，散在扩张的粗面内质网，部分成囊状，酶原颗粒胞膜不清，分泌颗粒减少，甚至消失。自然恢复组:C1:壁细胞水肿、微管泡系统明显减少，泡内可见絮状物质，基质出现大量液化现象，线粒体明显减少，嵴模糊不清、空泡变性或嵴断裂，可见轻微核固缩;C2:主细胞内粗面内质网和游离核糖体明显减少，酶原颗粒胞膜不清，分泌颗粒减少，甚至消失。埋线组:D1:壁细胞连接完好，核圆而染色尚均匀，线粒体丰富、结构清楚，微绒毛结构正常，胞浆内可见粘原颗粒和丰富的粗面内质网;D2:主细胞核圆且位于细胞底部，粗面内质网轻度扩张，酶原颗粒丰富，线粒体板层嵴清晰可见。

3 讨论

TLR4/NF－κB通路是各种炎症反应的重要传导通路之一［9］。TLR4是广泛分布于不同细胞表面的受体，通过激活细胞内NF－κB信号通路，活化的NF－κB进入细胞核通过与DNA相结合启动并调节炎症反应相关基因转录，趋化和激活嗜中性粒细胞，活化淋巴细胞，启动固有和获得性免疫［10－11］。NF－κB 是炎症呈持续放大反应的中心环节。目前已证实慢性萎缩性胃炎胃黏膜的IL－1、IL－6、IL－8及TNF－α等细胞因子和化学趋化因子升高相关，这些细胞因子和化学趋化因子可引起中性粒细胞的聚集和激活，从而可引起活动性炎症反应［12］。

本研究发现，在大鼠慢性萎缩性胃炎模型中TLR4、NF－κB表达均显著上调，提示 TLR4/NF－κB通路激活介导了萎缩性胃炎的炎症过程。经埋线治疗后大鼠胃黏膜组织TLR4、NF－κB表达较模型组和自然恢复组显著下调，提示其胃黏膜保护作用可能与抑制TLR4/NF－κB通路以减轻慢性炎症损伤有关，穴位埋线对于胃黏膜慢性炎症的改善在组织病理学上也得到了印证。另外，超微结构的改变主要体现在壁细胞线粒体和主细胞溶酶体上，穴位埋线能够明显改善线粒体、溶酶体的损伤，从而促进胃黏膜血液循环，促使胃黏膜各种异常的超微结构恢复［13］，从而起到对胃黏膜的保护和修复作用。

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