温针灸对吗啡戒断大鼠脑区CREBmRNA表达的影响*

卫 哲，董 哲，王 威

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001;2.哈尔滨市儿童医院，黑龙江哈尔滨 150010)

吗啡滥用给全世界带来了巨大损害，对吗啡成瘾后的戒毒治疗已成为医学界研究的热点。针灸治疗具有安全、可靠、副作用少等优点，已被广大患者认可，并很快得到推广应用［1］。温针灸能激发经气，促进周身气血流动，抗御外邪，使脏腑失调的功能趋于平衡。目前，关于温针灸改善大鼠戒断症状方面的研究尚不多见。本实验通过观察温针灸对减轻大鼠戒断症状的作用以及脑内环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP Yesponse element binding protein，CREB)mRNA 的表达，探讨其对戒断后中枢的影响机制。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠(黑龙江中医药大学实验动物中心提供)，40只，雄性，体重(190±30)g。动物在实验前进行适应性驯养1周。

1.2 主要试剂和药品

盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂，批号20080802);盐酸纳络酮注射液(成都倍特药业有限公司，批号20081103);逆转录酶AMV(Pormgea公司);Taq酶(上海生工)。

1.3 主要仪器与设备

AB－160型电子分析天平(山西太原航空航天工业部太行仪表厂)、ABI7500荧光定量PCR扩增仪(美国PerkinElme公司)等。

2 实验方法

2.1 动物分组

将40只大鼠随机分为对照组、模型组、温针灸组、手针组，每组10只。

2.2 造模方法

根据相关文献资料［2］进行造模，采用逐日递增法，在背部皮下注射盐酸吗啡注射液，剂量分别为20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg，每天2次(8 am、4 pm)，连续5天。于最后注射后3 h进行纳络酮戒断，用量为3 mg/kg，随后观察10 min内大鼠的戒断反应，将符合评分者作为模型动物。评分结果见表1。

表1 各组吗啡依赖大鼠戒断症状评分比较(±s)

表1 各组吗啡依赖大鼠戒断症状评分比较(±s)

注:与对照组相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型组 20.5 ±4.16△温针灸组 19.4 ±4.92△手针组 20.6 ±6.81组别 戒断总分对照组△

表1示，对照组以外的各组大鼠出现不同程度的戒断症状，并且与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，表明成功建立吗啡戒断大鼠模型。

2.3 各组处理

对照组与吗啡注射者以相同时间、方法注射生理盐水，第6天开始每日四肢捆绑固定。模型组按上述方法造模，第6天开始每日四肢捆绑固定。温针灸组于第6天开始进行温针灸治疗，取百会、双侧肾俞、三阴交、足三里，针刺得气后，在针尾上搓捏少许艾绒点燃施灸，只待燃尽，除去灰烬，留针稍许再将针拔出，共计留针15 min，治疗6天。手针组于第6天开始予针刺治疗，取穴方法同温针灸组，得气后留针15 min。

2.4 取材

治疗结束后的第二天将大鼠以戊巴比妥麻醉后开胸，固定液进行灌注固定，开颅，完整取出全脑组织，分离伏隔核(NAc)，液氮保存。

2.5 检测大鼠脑区CREB基因的表达

以Real－time PCR法进行检测。取300 mg组织样放置于－80℃保存的研钵中，倒入液氮，快速研磨，装入5 ml离心管中。加入4.5 ml Trizol提取液。室温温育5 min，12 000 rpm 离心10 min，取上清，加1 ml氯仿并离心15 min。移上清后加3 ml异丙醇混匀并放置，再次离心 10 min。弃上清，加 75%乙醇并7 500 rpm离心5 min。弃乙醇，干燥，加 DEPC－treat溶解总RNA，进行反转录［3－4］。具体操作过程按照试剂盒说明书进行。

2.6结果分析

选择β－action为内参，以SDS7000软件获得各样本的Ct值，通过2－△△Ct计算CREB相对mRNA表达水平。表达差别倍数以2－△△Ct表示。

2.7 统计学处理

由SPSS13.0统计软件包进行数据处理，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

大鼠NAc脑区CREBmRNA表达的变化，见表2。

表2 大鼠NAc脑区CREBmRNA的表达(±s，n=10，ng/L)

表2 大鼠NAc脑区CREBmRNA的表达(±s，n=10，ng/L)

注:与模型组比较，△P ＜0.05;与手针组比较，▲P ＜0.05。

组别 CT(CREB) CT(action) 2－ΔΔCT对照组 25.18 ±0.14 17.57 ±0.2 0.078(－0.156 －0.304)模型组 24.79 ±0.1820.91 ±0.22 1.0(0.91 －1.09)温针灸组 24.5 ±0.15 18.32 ±0.09 0.199(0.008 －0.388)△▲手针组 23.99 ±0.1419.24 ±0.31 0.648(0.477 －0.817)△

由表2所示，与模型组比较，温针灸组、手针组的脑区CREBmRNA表达明显降低，差异有显著性意义(P＜0.05)。与手针组比较，温针灸组脑区CREBmRNA表达降低，差异有显著性(P＜0.05)，说明针灸治疗可以调整大鼠戒断后CREBmRNA的表达，以温针灸对CREBmRNA表达改善为著。

4 讨论

本实验通过不同的针灸方法对吗啡成瘾后大鼠的戒断症状进行治疗，结果显示，温针灸能够减轻大鼠戒断症状，并且明显降低大鼠脑区的CREBmRNA表达(P＜0.05)，认为其参与了吗啡成瘾后戒断的中枢调节机制。

反复给药不但会出现一系列的成瘾表现，还会出现脑功能的长时程变化，并且出现基因表达调节改变［5］。一般认为，基因表达的关键是基因转录的调控，CREB转录因子家族调控多种基因的表达，在AC－cAMP系统的上调中似乎起关键作用，这可能是自身内稳态调节机制发挥作用的结果。研究发现，NAc不仅参与调控急性强化效应，同时介导吗啡依赖形成过程中长时程适应的改变［6］。

研究发现［7］，CREB在不同的神经元内调节不同目标基因，也可能是调节不同神经元产生相同的效应，但是最后的行为学效应不同。CREB能够参与调节行为记忆，并且起到关键作用。但相对来讲，CREB活性是短暂的，例如，慢性给药后CREB活性在药物撤退后几天内就恢复正常水平，这意味着这种长时转变可能启动与成瘾和记忆有关的更加稳定的行为改变，比如通过其他基因的调节，提示还应有其他因子参与［7－8］。

本实验初步分析温针灸对大鼠戒断症状的影响，其作用除了调节脑区CREB基因表达之外，还存在对其它多种基因的影响，针灸戒毒有很大的应用前景，还有待于进一步探讨其中枢作用机制。

［1］舒荣，文秀英，茹立强.国内外针灸戒毒研究进展［J］.中国针灸，2003，23(2):121 －125

［2］纪家涛，王新华，由振东，等.吗啡依赖大鼠模型的建立［J］.第二军医大学学报，1997，18(1):81 －82

［3］曾俊杰，孙凯，吴承堂，等.应用实时荧光定量PCR检测结直肠癌与癌旁组织中 miRNA－221的差异表达状况［J］.山东医药，2010，50(12):26 －28

［4］邹湘辉，庄东红，吴云影，等.实时荧光定量PCR检测小鼠脑组织中3－羟基丁酸受体基因PUMA－G的转录表达［J］.广东医学，2010，31(1):58 －60

［5］卫哲.电针对吗啡戒断后大鼠中枢谷氨酸－多巴胺动机环路作用机制的研究［D］.哈尔滨:黑龙江中医药大学，2011

［6］Hawes JJ，Narasimhaiah R，Picciotto MR.Calanin attenuates cyclic AMP regulatry element－binding protein(CREB)phosphorylation induced by chronic morphine and naloxon chanlleng in Cath.a cell and primary striatal cultures［J］.J Neurochem.2006，96:1160 －1168

［7］Berke JD，Hyman SE.Addiction，dopamine and the molecular mechanisms of memory［J］.Neuron，2000，25，515 －532

［8］Blendy JA，Maldonado R.Genetic analysis of drug addiction:The role of cAMP response element binding protein［J］.Journal of Molecular Medicine，1998，76，104 －110