TGFβ1和CD4+CD2 5+调节性T细胞表达在系统性红斑狼疮发病中的意义

孙保东 蔡文虹 洪小平 刘冬舟 黄 勤 谭艳红

暨南大学第二附属医院 深圳市人民医院风湿科，广东深圳 518020

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种典型的异质性自身免疫病，主要表现为自身反应性T、B淋巴细胞过度激活以及多种自身抗体（主要是抗核抗体）的产生，循环免疫复合物沉积或形成，导致多个系统器官损伤等。但SLE病因和免疫耐受紊乱机制等尚未阐明。

转化生长因子 β（transforming growth factorβ，TGFβ）是一种重要的负性免疫调节细胞因子，在人类中可分为TGFβ1～3，其中最重要的是 TGFβ1[1]。 CD4+CD25+调节性 T 细胞（Treg）是一种参与自身抗原外周耐受和外来抗原免疫应答调节的主要调节T细胞亚群，对维持外周免疫耐受有重要意义[2]。研究表明两者功能上存在着密切联系，如TGFβ可以促使幼稚T细胞向调节性T细胞分化成熟，调节性T细胞可通过分泌TGFβ发挥免疫抑制作用等[3]。因此，TGFβ和CD4+CD25+调节性T细胞分别在细胞因子和细胞水平上对维持机体免疫平衡、免疫耐受等起重要作用，两者数量或功能缺陷均可能导致或加重自身免疫病的发生发展[1-2]。

已有研究显示，SLE患者TGFβ和CD4+CD25+调节性T细胞表达和功能异常[4～8]，但结果不统一。为探索SLE免疫紊乱机制，本文对SLE患者血清TGFβ1和外周血CD4+CD25+调节性T细胞表达进行检测，并结合临床资料进行分析。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2011年6月～2012年9月本院风湿科门诊及住院SLE患者，均符合1997年美国风湿病学会（ACR）修订的SLE分类标准。据SLEDAI积分法分为活动组（≥10分）和稳定组（＜10分）。正常对照组为本院体检女性，体检结果无明显异常且年龄与SLE组患者相匹配。

1.2 血清 TGFβ1检测

所有受试者晨起空腹干燥管抽取静脉血2 ml，离心取血清，-80℃保存。采用ELISA法集中检测血清TGFβ1水平，采用美国R＆D公司TGFβ1检测试剂盒，操作按说明书。

1.3 CD4+CD25+调节性T细胞检测

采用流式细胞术检测法，取受试者100 μl抗凝静脉血，分别加入10 μl PE标记鼠抗人CD25单抗和FITC标记鼠抗人CD4单抗（均美国BD公司），室温避光放置30 min，再加入红细胞裂解液2 ml，室温避光10 min，2000 r/min低温离心5 min，弃上清，PBS 2 ml洗涤2次后再加入0.5 ml PBS重悬，EPILS-ALTRA型流式细胞分析仪（美国库尔特公司）检测，EXPO2软件分析。据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，测定标本CD4+CD25+调节性T细胞占总淋巴细胞百分率；以单个细胞抗CD25荧光强度≥10设为CD25high细胞，计算CD4+CD25high调节性T细胞占总淋巴细胞的百分率。

1.4 其他抗体检测

抗核抗体（ANA）采用间接免疫荧光法测定，抗可抽提核抗原抗体（ENA）采用免疫印迹法测定，抗双链DNA抗体（ds-DNA抗体）采用放射免疫法测定，血清补体C3、C4采用免疫比浊法测定等。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 SLE患者血清TGFβ1的表达水平

SLE活动组患者TGFβ1表达明显低于正常对照组和稳定组患者（P<0.01），而稳定组和正常对照组TGFβ1表达差异无统计学意义（P>0.05）（表 1）。

表1 SLE患者与对照组血清TGFβ1表达水平的比较（±s）

表1 SLE患者与对照组血清TGFβ1表达水平的比较（±s）

与正常对照组和稳定组比较，*P<0.01

组别 n年龄（岁） TGFβ1（pg/ml）正常对照组SLE组活动组稳定组20 55 23 32 35.8±12.0 36.5±14.0 35.6±12.5 37.4±14.6 1314±129 1191±458 715±414*1423±153

2.2 SLE患者CD4+CD25+、CD4+CD25high调节性T细胞的表达

活动SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25high调节性T细胞和CD4+T细胞占总淋巴细胞的百分率均低于正常对照组和稳定组患者（均P＜0.05），而稳定组SLE与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 SLE患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high调节性T细胞百分率（%，±s）

表2 SLE患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high调节性T细胞百分率（%，±s）

与正常对照组和SLE稳定组比较，*P＜0.05

组别 n年龄（岁，±s）CD4+CD25+ CD4+CD25high CD4+ CD4+中CD25+正常对照组SLE组活动组稳定组20 38 15 23 36.0±8.5 36.4±9.4 35.3±6.5 37.1±8.4 8.78±2.87 8.5±3.4 4.53±0.85*10.89±1.41 1.88±0.64 1.63±1.2 0.87±0.5*2.09±1.28 34.75±6.35 29.68±8.03 21.5±5.13*34.58±4.64 18.53±4.6 18.59±6.0 16.13±4.47 20.06±6.53

2.3 相关性分析

SLE患者TGFβ1表达、CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25high调节性T细胞数均与狼疮活动度SLEDAI积分成负相关（P＜0.05），与病程、免疫球蛋白、补体、抗ds-DNA量等未见明显相关性（均P>0.05）（表3）。15例患者同时检测TGFβ1和CD4+CD25+调节性T细胞数，两者之间未见明显相关性（r=0.51，P=0.113）。 此外，SLE 患者血清 TGFβ1表达与外周血小板数量和血红蛋白量成正相关（r=0.71，P=0.001 和 r=0.44，P=0.042）。

3 讨论

TGFβ是一种重要的负性免疫调节因子，可作用于免疫系统的各个环节，如抑制免疫活性细胞的增殖和分化，抑制细胞因子和抗体产生等。TGFβ表达或功能异常与自身免疫病的发生发展有关，如敲除TGFβ1基因老鼠临床表现与人SLE、干燥综合征极其类似[1]。本文检测结果显示，活动SLE血清TGFβ1水平明显下降，并且与疾病活动度呈负相关，而稳定期患者表达水平不低，这与多数报道结果一致[4-6]，提示TGFβ1表达可能参与SLE发病或促进病情活动，并可能有助于临床判断疾病活动度等。然而TGFβ1表达与其他临床指标如抗ds-DNA量、24 h尿蛋白定量、补体等未见明显相关性，提示TGFβ可能只是SLE发病的一个因素。活动SLE患者血清TGFβ1表达减少可能主要与外周血单个核细胞尤其是NK细胞产生TGFβ能力下降有关[1，4]。其次，发现患者TGFβ1水平与血小板数量成正相关，而活动SLE患者血小板常减少，这可能也是血清TGFβ1减少的一个原因。

表3 SLE患者TGFβ1、CD4+CD25+调节性T细胞与临床指标的相关性分析

CD4+CD25+调节性T细胞是近年来发现的一种最主要的调节性T细胞，即高表达CD25和Foxp3的CD4+调节性T细胞亚群。研究显示，CD4+CD25+调节性T细胞可对多种免疫细胞发挥抑制效应，如调控B细胞产生抗体等[9]，在维持机体自身耐受和自身免疫疾病发生发展中具有重要意义[2]。近期研究显示，多发性硬化[10]、哮喘[11]、特发性血小板减少性紫癜[12]等发病均与调节性T细胞异常有关。本研究显示，活动SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞表达减少，而稳定期患者与正常对照无差别，这与国内外报道结果基本一致[6-8]。有研究认为在人类外周血有免疫抑制活性的主要是CD4+CD25high调节性T细胞，本文以荧光强度≥10定义CD25high细胞，发现活动性患者CD4+CD25high也是降低的，并且与SLEDAI积分负相关，这均提示CD4+CD25+调节性T细胞可能参与SLE发病，并且可能和病情活动有关。但相关分析未发现外周血CD4+CD25+和CD4+CD25high调节性T细胞数与其他临床指标的相关性，说明它们可能没有直接参与SLE临床病理和临床表型等。不过，国内有学者报道CD4+CD25+调节性T细胞等与狼疮肾炎[13]、狼疮中医辨证分型[14]等相关，但本文并未发现狼疮患者蛋白尿或血尿与CD4+CD25+调节性T细胞相关性。活动期SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞减少的原因有待进一步阐明。早期有研究表明，SLE患者外周血CD4+细胞减少与病情活动相关，其减少可能与抗体所致破坏和凋亡过多有关[15]。本研究发现SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞比率与正常对照无差异，并且与CD4+T细胞数呈正相关，提示CD4+CD25+调节性T细胞减少可能主要是由于CD4+T细胞减少所致。因此，设法提高调节性T细胞数量和功能可能是SLE治疗的重要新方法。已有研究发现，雷帕霉素可以促进TGFβ1诱导分化的调节性T细胞增殖，且具有免疫抑制功能，这为体外回输调节性T细胞治疗自身免疫病提供了可能[16]。

TGFβ和CD4+CD25+调节性T细胞功能可能存在密切联系，已有研究表明，TGFβ1不仅是调节性T细胞的分泌因子，它更能调控调节性T细胞分化和功能[2-3]，而SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞分泌TGFβ异常[5，8]。本文对部分患者同时检测TGFβ1和CD4+CD25+调节性T细胞数，但未发现两者之间明显相关，这与陈伟等[4]报道一致，提示其表达可能受多种因素影响，功能上可能存在相对独立性。当然，也不排除例数少对统计结果的影响，必要时扩大样本数等深入研究其相互作用。此外，Foxp3基因表达对CD4+CD25+调节性T细胞形成和功能维持起重要作用，SLE患者CD4+CD25+调节性T细胞功能有无异常以及与TGFβ表达调控的关系等有待进一步研究。

[1]阎衡.转化生长因子β与自身免疫性疾病[J].国外医学免疫学分册，2002，25（1）：25-27.

[2]Vila J，Isaacs JD，Anderson AE.Regulatory T cells and autoimmunity[J].Curr Opin Hematol，2009，16（4）：274-279.

[3]夏桃林，吴振权，杨明，等.TGFβ1和 COX-2对CD4+CD25+调节性 T细胞的调控作用[J].医学综述，2010，16（22）：3390-3392.

[4]陈伟，李向培，翟志敏，等.系统性红斑狼疮患者外周血调节性T细胞与 TGF-β 水平变化及其意义[J].山东医药，2006，46（32）：11-13.

[5]Lu LY，Chu JJ，Lu PJ，et al.Expression of intracellular transforming growth factor beta1 in CD4+CD25+cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].J Microbiol Immunol Infect，2008，41（2）：165-173.

[6]姜有金，陈兴国，潘玉琴，等.SLE患者血中调节性T细胞及TGF-β1 的表达[J].放射免疫学杂志，2010，23（6）：605-608.

[7]Habibagahi M，Habibagahi Z，Jaberipour M，et al.Quantification of regulatory T cells in peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus[J].Rheumatol Int，2011，31（9）：1219-1225.

[8]赵宏丽，赵俊芳，李孟娟，等.系统性红斑狼疮患者CD4+CD25+调节性T细胞及其细胞因子的改变[J].中国皮肤性病杂志，2012，12（7）：581-583.

[9]Crispin JC.Regulatory T cells as modulators of B cell antibody production[J].Clin Immunol，2011，140（3）：216-217.

[10]于周，李作孝.CD4+CD25+调节性T细胞、Foxp3与多发性硬化的关联[J].中华神经医学杂志，2009，8（1）：98-100.

[11]Langier S，Sade K，Kivity S.Regulatory T cells in allergic asthma[J].Chest，2012，14（3）：180-183.

[12]郭新红，范佳鑫，阿依姆妮萨·阿卜杜热合曼，等.CD4+CD25+CD127low调节性T细胞及相关细胞因子与慢性特发性血小板减少性紫癜的研究[J].中国免疫学杂志，2011，27（1）：73-75.

[13]郑京，郑春盛，陈雪兰，等.Treg、TGF-β、IL-17对狼疮性肾炎的影响及相互关系[J].中华风湿病学杂志，2010，14（1）：25-28.

[14] 王菊霞， 郑京.调节性 T 细胞、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17 对系统性红斑狼疮的影响及其与中医证型的关系[J].山东中医药大学学报，2012，36（2）：120-122.

[15]Amasaki Y，Kobayashi S，Takeda T，et al.Up-regulated expression of fas antigen（CD95）by peripheral naive and memory T cell subsets in patients with systemic lupus erythematosus （SLE）：a possible mechanism for lymphopenia[J].Clin Exp Immunol，1995，99（2）：245-250.

[16]刘华，何敏，刘建胜，等.雷帕霉素对TGF-β1诱导的Treg细胞的体外影响[J].中南药学，2010，8（6）：437-441.