葛根素干预对糖尿病肾病大鼠降钙素基因相关肽的影响研究

龚志刚 宋春晖 石向群

1.江西师范大学体育学院，江西南昌 330022；2.江西师范大学生命科学学院，江西南昌 330022；3.九江学院基础医学院，江西九江 332000

降钙素基因相关肽 （calcitonin gene-related peptide，CGRP）是1983年由国外学者Rosenfeld MG等[1]发现的一种具有复杂生物功能的活性多肽，是迄今为止所知的体内最强的内源性舒血管多肽，CGRP与糖尿病肾病的发生发展关系密切。许多研究证实，糖尿病患者血浆CGRP水平降低，且在合并糖尿病肾病时降低更明显[2-4]。本文拟结合葛根素（puerarin）防治糖尿病的作用机理，通过对糖尿病肾病大鼠腹腔注射葛根素注射液，来观察葛根素对血浆中CGRP的影响，为DN的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

葛根素注射液 （黑龙江哈尔滨医大药业有限公司提供，国药准字 H20044142，批号：2010-03-12）；链尿佐菌素（STZ，美国Sigma公司），临用前用柠檬酸缓冲液配成l%的STZ溶液；大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）试剂盒，内皮素（ET）试剂盒，尿微量白蛋白（U-mAIb）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 仪器

GC-911γ放射免疫计数器（中国科技大学创新股份有限公司）、DNM-9602型酶标仪 （北京普朗新技术有限公司）、HH-8数字显示恒温水浴箱 （常州国华仪器公司）、便携式血糖仪（日本京都公司）、DT-1001电子天平（江苏常州衡器厂）、低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 动物

6周龄Sprague-Dawley雄性大鼠40只，由南昌大学实验动物中心提供，平均体重（220.0±15.6）g，单笼喂养，室温20℃，相对湿度 50%，1 d 中光照∶黑暗时间为 12 h∶12 h，自由摄食饮水。

1.4 实验方法

1.4.1 动物建模 40只大鼠预养一周后，随机选取一组10只为正常对照组，剩余30只空腹12 h，腹腔注射1%STZ-柠檬酸钠缓冲液35 mg/kg体质量。对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液，依据72 h后尿糖+++～++++，尾静脉采血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L者，确定模型建立。除去造模失败及实验过程中死亡大鼠，将糖尿病鼠22只纳入本实验。

1.4.2 分组 （1）正常对照组（CN组10只）：糖尿病鼠随机分为；（2）糖尿病组（D 组 11 只）：（3）葛根素治疗组（S 组11只），S组每只给予160 mg/kg/d葛根素注射液进行腹腔注射，CN组腹腔注射等容量0.9%氯化钠溶液，均连续干预14周。

1.4.3 标本采集 第14周实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24 h尿液，测定尿白蛋白含量，动物经乙醚麻醉后心脏取血。测试生化指标：（1）空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）采用便携式血糖仪测定；（2）尿微量白蛋白（urinary microalbumin，U-mAIb）采用 ELISA 法测定；（3）内皮素（endothelin，ET）采用放免法测定；（4）降钙素基因相关肽（CGRP）用放免法测定。

1.5 统计学方法

所有数据用SPSS 12.0软件进行统计分析，实验所得数据均以均数±标准差（±s）表示，各组均数之间均用单因素方差检验（one-way ANOVA）进行差异性比较，其中P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病大鼠模型的建立

注射STZ后72 h，糖尿病组空腹血糖明显升高 （P<0.01），空腹血糖均值达到19.51 mmol/L；葡萄糖耐量试验：两组大鼠禁食12 h后，按2 g/kg·BW葡萄糖进行灌胃，尾部微量取血，分别测0.5、1.0、2.0 h血糖。实验组大鼠1 h血糖值达到高峰，2 h仍高；对照组0.5 h达到高峰，2 h恢复空腹水平，提示实验组出现糖耐量异常，且实验组大鼠空腹血糖≥16.7mmol，表明糖尿病大鼠造模成功。见表1。

表1 两组大鼠血糖和葡萄糖耐量试验结果（±s，mmol/L）

表1 两组大鼠血糖和葡萄糖耐量试验结果（±s，mmol/L）

注：与对照组比较，＃P<0.05，＃＃P<0.01

组别 空腹血糖 葡萄糖耐量试验0.5 h 1 h 2 h对照组实验组4.67±0.78 19.51±2.51＃＃7.82±1.29 27.31±2.53＃＃5.91±0.56 29.69±2.99＃＃5.06±0.40 24.02±3.57＃＃

2.2 葛根素干预对DN大鼠相关生化指标的影响

各组测得FBG、U-mAIb和ET值，D组和S组都较CN组显著升高（P<0.05），经过14周葛根素干预后，S组较D组显著下降（P<0.05）；而血浆CGRP值，D组和S组较CN组显著下降（P<0.05），且 S组较 D 组明显升高（P<0.05）。见表2。

3 讨论

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病时肾脏病理改变中只有肾小球硬化症的全身微血管并发症之一，主要病理特征是肾脏高灌注、高滤过、肾小球基底膜增厚和系膜细胞增生及细胞外基质增生，导致弥漫性或结节性硬化，出现蛋白尿、高血压、水肿、肾衰竭等变化，现临床上已认定U-mAIb是DN诊断的标准之一[5]。CGRP是目前已知在体内作用最强的扩张血管活性多肽，其通过与肾脏血管床上CGRP受体结合，引起肾脏血管的舒张作用，且可抑制血管平滑肌细胞增殖，促进内皮细胞的增殖与修复[6]。另外CGRP可使肾小球系膜细胞舒展，从而增加肾小球滤过面积及滤过率，对肾脏血管具有强大的保护作用[7]。CGRP和U-mAIb的联合检测可能作为DN的监控指标。

表2 各组大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的变化（±s）

表2 各组大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的变化（±s）

注：与CN组比较，aP<0.05，与D组比较，bP<0.05

组别 只数 FBG（mmol/L）U-mAIb（μg/min）ET（pg/mL）CGRP（pg/mL）CN组D组S组10 11 11 5.20±0.63 20.54±1.76*16.65±2.3*#14.87±5.65 169.77±40.56*124.32±48.78*#59.59±23.13 112.43±27.66*88.96±24.26*#276.51±76.77 178.99±45.44*226.76±64.88*#

本实验结果显示，模型组大鼠U-mAIb升高，血浆CGRP降低，表明模型组已出现DN症状。DN体内持续的高血糖导致血管内皮细胞损伤，使ET分泌增加。ET作为血管活性多肽均可与肾脏相应受体结合，使肾小球毛细血管压增加，从而导致尿蛋白漏出增加。而CGRP对ET具有生物学拮抗作用，已被学者证实[8]。

葛根素作为豆科葛根中提取的异黄酮类化合物，《本草纲目》记载其有生津止渴的功效，目前研究已证实葛根素对糖尿病有治疗作用[9]。现代药理研究表明，葛根素能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血浆ET、血管紧张素Ⅱ及肾素活性，从而扩张微动脉，改善肾小球的缺血、缺氧及高凝状态[10]；同时还可清除糖基化反应所产生的自由基，提高机体抗氧化能力[11]。本实验通过14周葛根素干预后，DM大鼠U-mAIb显著减少，ET下降明显，CGRP较模型组明显增加，从而延缓DN发生发展的病理进程。崔秀玲等[12]研究发现：DM模型组大鼠尿清蛋白排泄率显著升高，且随病程延长而增加，表明DM可以损伤肾小球，且随病程的延长损伤加重。分别采用低、中、高剂量葛根素治疗后，尿清蛋白排泄率较正常对照组有一定程度升高，但明显低于中剂量组，提示葛根素对DM模型大鼠肾脏有较好的保护作用。本研究亦表明葛根素对DN有明显的改善作用，其部分原因可能是通过提升CGRP的作用，拮抗或抑制ET的释放，使肾脏血管舒张，改善微循环，减少U-mAIb的排放。但其具体的机制还待进一步研究。

[1]Rosenfeld MG，Mermod JJ， Amara SG，et al.Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing[J].Nature，1983，304（5922）：129-135.

[2]Helset E，Kjaeve J，Bjertnase L，et al.Acute alveolar hypoxia increase endothelin-1 releasebut decrease release of calcitonin gene-related peptide in isolated perfused rat lungs[J].Scand JCl in Lab Invest，1995，55（5）：369-376.

[3]胡玲，林小红，张选均，等.血浆降钙素基因相关肽与糖尿病微血管病变的关系[J].临床心血管杂志， 1996，6（12）：383.

[4]王宪，孙威，刑立愚，等.糖尿病大鼠肠系膜动脉降钙素基因相关肽释放减少以及一氧化氮的作用[J].生理学报，1998，5（2）：206-211.

[5]Gross JL，Azevedo Mj，Silveiro SP， et al.Diabetic nephropathy： diagnosis， prevention，and treatment[J].Diabetic Care，2005，28（1）：164-176.

[6]Nozaki K，Okamoto S，Vemura Y，et al.Vaseular relaxation Proportion of Caleitonin gene-related Peptide and vasoaetive intestinal polypeptide in subarachnoid haemorrhage[J].J Neurosurg，1990，72：792-797.

[7]曹翠平.降钙素基因相关肽、内皮素与糖尿病肾病的关系及干预治疗的临床意义初探[D].沈阳.中国医科大学，2004：30.

[8]Wang Y，Wang DH.Prevention of endothelin-1-induced increases in blood pressure：role of endogenous CGRP[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（4）：1868-74.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.广州：广东科技出版社，1995：297.

[10]苏春晕.实用中药药理新编[M].兰州：甘肃科学技术出版社，1997：179.

[11]龚志刚，朱笃，胡红霞，等.葛根素对糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影响[J].食品科学，2006，27（11）： 498-501.

[12]崔秀玲，王远征，刘晓健.葛根素对糖尿病模型大鼠尿清蛋白排泄率的影响[J].医药导报，2010，：29（2）：163-164.