电针对阿尔茨海默病大鼠海马P K C和G DNF表达的影响

张海燕 刘忠锦 冯化杰 廉 洁 陈志伟 黄 健

1.齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江齐齐哈尔 161006

阿尔茨海默病是老年人常见的神经系统退行性疾病，主要病理特征为细胞外老年斑中β淀粉样蛋白的沉积、细胞内由成对的过度磷酸化的Tau蛋白组成的神经原纤维缠结[1]，其病因及发病机制尚不清楚，多种治疗方法目前正在探索中[2]。神经营养因子（NTFs）与神经系统疾病密切关系。而胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是神经营养因子家庭中的一名新成员。关于电针治疗AD大鼠海马GDNF表达的方面比较少，本研究主要观察电针对AD大鼠海马PKC和GDNF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组

清洁级健康Wistar大鼠45只，雄性，体重200～250 g，白求恩医大实验动物中心提供，合格证号2010002，经水迷宫测试筛选40只，随机分为4组：正常组、模型组、西药组和电针组，正常组常规饮水和饲料。其余3组大鼠均采用链脲霉素（STZ）所致AD模型，模型组造模后不治疗。参照华兴邦等[3]的大鼠穴位图谱，电针组针刺双肾俞（第二腰椎棘突下左、右侧旁开7 mm）、双足三里（腓骨小头下约5 mm处）、百会（顶骨正中）、大椎（第七颈椎与第一胸椎间）[4]等穴治疗，用 0.25×0.25 mm华佗牌无菌毫针针刺，连接KWD-808全能脉冲电疗仪，电压为2 V，频率为30 Hz，，强度以肢体局部轻微颤动为适。西药组采用氢溴酸加兰他敏灌胃 0.5～1.0 mg/（kg·d），治疗 4 周。

1.2 主要试剂和仪器

氢溴酸加兰他敏，链脲霉素STZ（注射前将STZ溶于0.9%氯化钠溶液）。PKC免疫组化检测试剂盒（博士德生物工程有限公司），GDNF免疫组化检测试剂盒 （博士德生物工程有限公司），脑立体定位仪，水迷宫，Hans电针仪，Olympus显微镜。

1.3 模型复制

10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，在头部做正中矢状切口，坐标为脑表面下3.5 mm，前囟1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm。在每侧侧脑室注射10%链脲霉素10 μL，创口缝合。3 d后重复注射一次。

1.4 各组大鼠标本的制备

大鼠治疗4周后，麻醉后暴露出心脏，左心室插入灌注针头，快速灌入无菌生理盐水冲洗组织内血液，同时剪开右心耳，冲洗至肝脏变白，然后灌注4%多聚甲醛，当大鼠尾巴、四肢僵硬时断头取脑，分离海马[5]。一侧海马装入冻存管，一侧置于4%多聚甲醛中，浸泡固定，取海马标本，脱水包埋切片。

1.5 免疫组织化学染色大鼠海马PKC和GDNF

PKC、GDNF免疫反应阳性产物为棕黄色点状颗粒，主要分布在胞浆。采集免疫组化染色图像，用Imagepro-Plus分析软件进行图像分析，每张切片区6个视野测定海马组织中阳性细胞数，所得数据经SPSS 17.0系统处理，数据结果以均数±标准差（±s）表示。

2 结果

正常组、模型组PKC和GDNF蛋白有较高表达，模型组PKC和GDNF蛋白表达水平显著降低，治疗后西药组、电针组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 电针对海马PKC和 GDNF表达的影响（±s，n=10）

表1 电针对海马PKC和 GDNF表达的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，＊P＜0.05

组别 海马PKC阳性细胞数（个/高倍视野）海马GDNF表达阳性细胞数（个/高倍视野）正常组模型组西药组电针组32.17±13.52＊16.26±3.58 28.34±10.68＊27.49±11.71＊96.31±8.94＊72.38±6.15 88.62±7.49＊86.73±7.65＊

3 讨论

PKC是一类由多种同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，PKC参与学习记忆与影响长时程增强 （longterm potentiation，LTP）的形成有关，在神经细胞内PKC的激活参与了离子通道的调节、受体的失敏、神经递质的释放及突触传递。PKC的激活是突触可塑性及LTP形成的分子机制之一。Cordey M等[6]研究证明经典的PKC亚型能够阻止Aβ诱导的神经细胞死亡。唐勇等[7]电针治疗AD大鼠后发现，海马PKC和酪氨酸蛋白激酶的活性发生变化，电针治疗可能激活蛋白激酶信号通路，从而提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力。星形胶质细胞能释放胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）等大量的活性物质，可以防止神经元凋亡，促进神经元修复和神经生长。研究发现[8]电针治疗后的AD大鼠神经营养因子家族重要成员的脑源性神经营养因子和神经胶质细胞源性神经生长因子表达也显著增加。本实验结果模型组大鼠海马PKC、GDNF表达降低，经治疗后电针组表达增加 （P＜0.05）。

中医学认为老年性痴呆是由于阴阳、气血、脏腑功能失调所引起的虚实夹杂的疾病，电针具有促进气血运行，疏通经络、调节平衡的特点[9]。本实验显示，电针刺激可激活PKC阻止神经细胞死亡，从而使胶质细胞高表达GDHF mRNA。对AD大鼠海马GDNF mRNA表达有正向调节作用。可见对损坏的海马神经元有修复作用，使AD大鼠痴呆症状得以改善。这可能是电针能有效地防治老年性痴呆的作用机制。

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[6]CordeyM，PikeC.Conventionalprotein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen[J].Neurochem，2006，96（1）：204-217.

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