高效液相色谱法检测月饼中丙烯酰胺的含量

陆文蔚，黄玥，艾清，白晨

（上海商学院食品系，上海 200234）

高效液相色谱法检测月饼中丙烯酰胺的含量

陆文蔚，黄玥，艾清，白晨*

（上海商学院食品系，上海 200234）

摘 要：研究了高效液相色谱测定月饼中丙烯酰胺的方法。采用Inertsil ODS-SP（250 mm×46 mm）色谱柱，以210 nm为检测波长，以5%乙腈水溶液作为流动相，流速为0.8 mL/min，柱温25℃，进样量20 μL。该方法的最低检测限为0.124 μg/kg。丙烯酰胺在0.1 mg/L～1.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，回收率大于80%。结果显示：固相萃取与溶剂萃取都适合作为样品预处理方法，适合这类焙烤食品的检测。

关键词：丙烯酰胺；月饼；高效液相色谱法

2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片中检出丙烯酰胺[1]。淀粉类食品在高温（＞120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺[2-3]，大量动物试验证明其具神经毒性[4]，生殖毒性[5]，致癌性[6]等。丙烯酰胺的形成与加工烹调方式、温度、时间有关，即使不同批次生产出的相同食品，其丙烯酰胺含量也有很大差异。挪威、英国、瑞士和美国等国家相继报道有关食品的丙烯酰胺含量，我国淀粉类食品非常丰富，烹调方式多样，其中焙烤、煎炸方式较多，科研人员对部分煎炸、烧烤等食品等进行了检测分析[7]。食品中丙烯酰胺的检测已列为国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法的建立和我国食品丙烯酰胺分布调查作为一个重要部分[8]。因此，本研究试图通过对月饼样品的HPLC检测，同时考察溶剂萃取与固相萃取对样品分析结果的影响，为传统焙烤食品丙烯酰胺的检测提供方法依据。有助于了解我国传统食品中丙烯酰胺的分布情况。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与样品

1.1.1 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司；HAMILTON手动进样针：岛津技迩商贸有限公司；756CRT紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL80-2B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；XW-80A微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；WondaSep C18固相小柱：岛津-GL商贸有限公司；HP01无油真空泵过滤装置：天津市恒奥科技发展有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海恒一科技有限公司。

1.1.2 试剂

乙腈（纯度≥99.9%，色谱纯）：德国默克化工产品；丙烯酰胺标准品（纯度99.9%，色谱纯）：阿法埃莎化学有限公司；甲醇（纯度≥99.8%，色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；正己烷（纯度≥97.0%，分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；超纯水。

1.1.3 样品

样品1（某苏式月饼）、样品2（某广式月饼）、样品3（油炸薯片）、样品4（非油炸薯片）：均购自超市。

1.2 方法

1.2.1 丙烯酰胺标准品的配制及工作曲线绘制

准确吸取丙烯酰胺标准储备液（100 mg/L）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于 100 mL 容量瓶中，纯水稀释至刻度，配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 的丙烯酰胺标准工作液。以丙烯酰胺标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作出标准曲线，并且求得回归方程。

1.2.2 样品的提取、纯化

取样品20 g（月饼取面皮），真空干燥，粉碎后的样品置于冰箱中保存。

1）溶剂萃取法：准确称取2.5g样品，加入甲醇：水（1∶1）溶液 10 mL，漩涡振荡器混合后，3 000 r/min离心 10 min，取上清液，残渣再用少量甲醇∶水（1∶1）溶液清洗2次～3次，离心，合并上清液。用20 mL正己烷分次洗入250 mL分液漏斗中，提取3次，收集提取液，然后用甲醇∶水（1∶1）溶液准确定量，经0.45 μm滤膜过滤后，用于HPLC分析。

2）固相萃取法：准确称取2.5g样品，加入纯水10mL，漩涡浴振荡器混合后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，将残渣再用少量纯水清洗2次～3次，合并上清液，经0.45 μm水系滤膜过滤，定量，备用。取C18小柱，用甲醇、水进行活化。然后取样液3mL过固相萃取小柱，洗脱液经0.45 μm滤膜过滤后，用于HPLC分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为 Inertsil ODS-SP（250 mm×46 mm）色谱柱，以含5%乙腈水溶液为流动相，SPD-20A型紫外检测器，柱温为25℃，流速为0.8mL/min，进样量为20μL。

1.2.4 定性定量方法

采用标准物质的保留时间对样品进行定性；定量方法是根据丙烯酰胺标准的浓度和色谱峰面积作出标准曲线，根据样品测定时丙烯酰胺的色谱峰面积计算出相应的提取液中丙烯酰胺的浓度，再经换算即可得到样品中丙烯酰胺的含量。

1.2.5 最低检出限的测定

对丙烯酰胺标准工作液进行稀释，对各浓度稀释液进行检测分析，确定能检出的最低浓度。用最低浓度标准溶液平行测定11次，得出标准偏差及方法标准曲线的斜率，计算最低检出限。

1.2.6 回收率实验

选择丙烯酰胺标准工作液浓度为0.5 mg/L，样品及加标样品，经过净化、膜过滤后测定，计算回收率。

1.2.7 精密度实验

将浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 的标准溶液按色谱条件重复测定6次，并取平均值计算精密度。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

对丙烯酰胺标准溶液进行紫外光谱扫描，发现在210 nm处有最大吸收峰，因此选择210 nm为检测波长，紫外扫描光谱结果见图1。

图1 丙烯酰胺紫外扫描光谱图Fig.1 Ultraviolet spectrogram acrylamide of detected

2.2 丙烯酰胺标准物的保留时间

丙烯酰胺标准品色谱图见图2。

图2 丙烯酰胺色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of standard acrylamide

经测定，丙烯酰胺出峰时间为（5.640±0.007）min。

2.3 丙烯酰胺标准工作曲线及线性范围

丙烯酰胺工作曲线如图3所示。标准溶液浓度在0.1 mg/L～1.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，回归方程为 y=2 000 000x+114 281，R2=0.999 4。

图3 丙烯酰胺的工作曲线Fig.3 Working curve of acrylamide

2.4 丙烯酰胺标准液的最低检测限

对 0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001、0.000 5 mg/L的丙烯酰胺标准溶液进行检测分析，结果表明浓度为0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001 mg/L 的丙烯酰胺标样均能较好的检测出，浓度为0.000 5 mg/L的标样则很难检测出。所以该方法最低检出限为0.124 μg/kg。

2.5 样品检测色谱图

由于月饼等传统焙烤食品的基底复杂，有效的样品预处理方法对于可靠地分析结果至关重要。固相萃取近年来作为HPLC样品纯化的新方法，由于其快速、溶剂用量少等特点，备受关注。传统溶剂萃取法虽然操作比较繁琐，但试剂耗材比较简单，稳定性较高，同样适合常规实验室工作的开展。分别用两种方法进行纯化后，两种样品处理方法对样品分离效果的影响见图 4～图 7。

图4 样品1经过溶剂萃取后的色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of sample 1 by solvent extraction

图5 样品1经过固相萃取后的色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of sample 1 by solid phase extraction

图6 样品2经过溶剂萃取后的色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of sample 2 by solvent extraction

图7 样品2经过固相萃取后的色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of sample 2 by solid phase extraction

如图5、图7所示，固相萃取作为纯化方法，色谱图中杂峰更少，样品中丙烯酰胺的色谱峰与杂质峰分离较好，峰型也较好。

2.6 样品检测结果的准确度与精密度实验

以回收率衡量方法的准确度，样品测定回收率的结果见表1。精密度实验结果见表2。

表1 回收率测定结果Table 1 Recovery of acrylamide in sample

表2 方法的精密度实验结果Table 2 Precision of method

结果表明：两种提取纯化方法所得测定结果的回收率在80%以上，该色谱方法的相对标准偏差（RSD）在0.17%～4.33%之间。

两种提取方法的样品回收率进行t检验，样品1的|t|=3.873＜ t(2，0.05)（4.303），样品 2 的|t|=0.624＜ t(2，0.05)（4.303），说明两种提取方法的回收率无显著性差异。本次实验结果表明，固相萃取与溶剂萃取都适合作为月饼等传统焙烤食品前处理的方法。

2.7 月饼中丙烯酰胺含量测定结果

使用溶剂提取法处理样品，高效液相色谱分析月饼中丙烯酰胺的含量，同时测定了某油炸薯片和非油炸薯片，测定结果见表3。

表3 样品中丙烯酰韩含量的测定结果Table 3 Eetermination result of acrylamide in sample

结果显示：样品1、样品2面皮中的丙烯酰胺含量为0.795 mg/kg、2.079 mg/kg，分别是来自苏式月饼样品与广式月饼样品。

据推测，苏式月饼面皮质量占月饼总质量的50%左右，广式月饼面皮质量占月饼总质量的30%左右，因此，实际摄入月饼时，皮中丙烯酰胺占月饼总质量应在1 mg/kg以下。

实验结果同时显示：油炸薯片样品丙烯酰胺含量较高，与相关文献中所记载的含量相符，非油炸薯片样品的含量比油炸薯片样品的含量高出一倍多，推测非油炸薯片中丙烯酰胺的平均含量可能会高于油炸薯片，这一结果值得进一步探讨。

3 结论

经过本次实验结果证实，作为传统焙烤食品，月饼中丙烯酰胺的平均含量应低于1 mg/kg，同时发现苏式月饼与广式月饼面皮丙烯酰胺的含量分别是0.795、2.079 mg/kg，存在较大差距。可以推测，加工工艺是主要影响因素。我国传统焙烤食品资源十分丰富，配方、工艺、特别焙烤温度相差巨大，如能够进一步改良工艺、规范流程，可以使焙烤食品向着更为安全、营养的方向发展。

薯片作为丙烯酰胺含量高的食品之一，含量高低也随着加工工艺不同有着极大区别，油炸薯片样品丙烯酰胺含量为3.709 mg/kg，非油炸薯片样品的含量为9.125 mg/kg，推测非油炸薯片很有可能比油炸薯片中丙烯酰胺的含量更高，这需要进一步试验与探讨。

气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对仪器设备要求较高，耗时较长，不利于在常规实验室展开。高效液相色谱法（HPLC）可作为一种快速、较简便的分析方法在许多实验室推广，便于满足我国日常食品监督检测工作的需要。经过研究，该方法的加标回收率在80%以上，相对标准偏差（RSD）在0.17%～4.33%之间，有较好的准确性与稳定性，可以检测月饼等传统焙烤食品中丙烯酰胺含量，具有步骤简单、结果准确的特点。

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Determination of Acrylamide in Moon Cake by High Performance Liquid Chromatography

LU Wen-wei，HUANG Yue，AI Qing，BAI Chen*
（The Department of Food Science，Shanghai Business School，Shanghai 200234，China）

Abstract：The method of high performance liquid chromatography for acrylamide determination in moon cake was established.The acrylamide was separated on a C18column （Inertsil ODS-SP，250 mm×46 mm）with 5%acetonitrile-water solution as mobile phase， and detected at 210 nm.The limit of detection is 0.124 μg/kg.The linear plots were obtained were obtained between 0.1 mg/L-1.0 mg/L.Overall recoveries were higher than 80%and RSD value were between 0.17%and 4.33%.The experiment results showed that solid phase extraction and solvent extraction were suitable for analysis of acrylamide in moon cake.

Key words：acrylamide；moon cake；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.025

上海商学院校级教改项目（编号：253110）；中央财政支持地方高校发展专项资金项目（编号：YC1105-D-4-1）

陆文蔚（1979—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品分析检测教学与科研工作。

2012-10-19