雷公藤内酯醇对弥漫性大B淋巴瘤细胞株凋亡的影响及其机制探讨

师宪平，蓝晓莹，温创宇，陈 鑫，刘焕亮

(1广州医学院免疫研究所，广州 510182;2中山大学胃肠病学研究所;3中山大学附属第六医院)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是常见的成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)，治疗棘手。传统化疗药物效果不理想，患者5年生存率较低［1］。雷公藤俗名断肠草，系卫矛科雷公藤属木质藤本植物，生长于山地林缘阴湿处，治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮和银屑病效果显著。研究显示，雷公藤除具有抗炎和抗移植排斥反应外，还有较强的抗肿瘤作用［2］，可抑制白血病细胞增殖和诱导细胞凋亡［3］;可使人胃腺癌细胞株MGC80-3异种移植小鼠的肿瘤体积缩小90%［4］。雷公藤内酯醇(TPL)为雷公藤中提取的一种含有3个环氧基的二萜内酯活性化合物，有显著的抗肿瘤、抗炎症等作用［5］。2011年11月～2012年11月，我们观察了TPL对DLBCL的抑制作用，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 弥漫性大B淋巴瘤细胞株SU-DHL-4购自中国医学科学院血液学研究所;MTS、碘化丙啶(PI)、细胞凋亡双染检测试剂盒、吐温-20(Tween-20)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司;抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Pro-caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase3)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)为Cell Signaling公司产品;抗二磷酸腺苷核糖多聚酶(PRAP)为BD Biosciences PharMingen公司产品;抗X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、髓样细胞白血病-1(Mcl-1)抗体购自Santa Cruze公司;抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸化信号传导与转录活化因子(P-STAT5)、信号传导与转录活化因子(STAT5)抗体购自Upstate Technology公司，辣根过氧化物酶(HRP)-抗鼠/兔Ig抗体为Pierce Biotechnology公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将 SU-DHL-4细胞置于 RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 TPL干预及细胞增殖活性检测 取生长良好的SU-DHL-4细胞置于96孔板，15000个/孔，分别采用 0、0.03125，0.0625、0.125、0.25 及 0.5 μmol/L(μM)的TPL作用72 h。于实验各孔分别加MTS试剂20 μL，37℃继续孵育4 h，采用酶联免疫检测仪测定各孔490 nm波长处的吸光度值(A值)。以TPL浓度为横坐标，细胞增殖活性为纵坐标绘制SU-DHL-4细胞增殖活性抑制率曲线。

1.2.3 TPL干预及细胞凋亡率测定 取生长良好的SU-DHL-4细胞(2×105个/管)，分别采用 0、0.1、0.2、0.3 μM 的 TPL 处理 36 h。处理后收集细胞，1 ×binding buffer洗涤，AnnexinV 工作液 100 μL室温孵育15 min，采用AnnexinV/PI双标记法流式细胞术(能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞)测定细胞凋亡率。检测前每管加PI 1 μL上机。按照Sigma-Aldrich公司提供的试剂说明书操作，实验重复3次，取均值。双变量流式细胞仪的散点图上右下象限代表晚期凋亡细胞，右上象限代表早期凋亡细胞，其总和计为凋亡细胞。

1.2.4 TPL干预及细胞凋亡相关蛋白、增殖相关蛋白表达检测 采用 0、0.1、0.2、0.3 μM 的 TPL 处理细胞36 h，再用0.2 μM 的 TPL 处理12、24、36 h(对照组不予TPL处理)。收集细胞，加入蛋白裂解液充分裂解细胞提取蛋白，用Bio-Rad蛋白浓度试剂盒在酶标仪中选750 nm波长定量蛋白浓度;100～130 V恒压电泳约90 min，100 V恒压转膜约90 min，5% 牛奶室温封闭1 h，一抗4℃过夜，次日曝光，对定性结果进行分析，在保证蛋白上样质量一致的情况下(管家基因所表达的GAPDH条带深浅一致)，观察各蛋白所对应条带的深浅，采用Western blot法测定细胞凋亡蛋白及增殖蛋白表达。凋亡蛋白包括 PARP 、Pro-caspase3、Pro-caspase8、XIAP、Mcl-1，增殖蛋白包括 AKT、ERK、STAT5。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 4.0软件行统计学处理。细胞凋亡率和细胞抑制率比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖活性 TPL达0.125 μmol/L时，细胞增殖出现明显抑制(P＜0.05)，随TPL剂量增加，细胞抑制率明显增高(图1)。TPL对细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)为0.131 μM。

图1 TPL对SU-DHL-4增殖活性的影响

2.2 细胞凋亡率 与对照组比较，各TPL干预组早期和晚期凋亡细胞均明显增加(图2)，P＜0.05。

2.3 凋亡相关蛋白表达 见图3。PARP呈TPL剂量与时间依赖性切割，Pro-caspase3、Pro-caspase8呈剂量与时间依赖性降低，而凋亡抑制蛋白XIAP与Mcl-1表达随TPL浓度升高和作用时间延长而降低。

图2 TPL对SU-DHL-4凋亡的影响

图3 TPL对SU-DHL-4凋亡相关蛋白表达的影响

2.4 增殖相关蛋白表达 见图4。结果显示TPL对增殖相关蛋白AKT、ERK和STAT5及其磷酸化形式的表达，具有剂量与时间依赖性下调作用。

图4 TPL对SU-DHL-4增殖相关蛋白表达的影响

3 讨论

DLBCL是成人恶性淋巴瘤最常见的类型之一，在形态学和临床表现上均具有显著的异质性，传统化疗药物治疗预后差，筛选新的能有效杀伤DLBCL细胞的小分子化合物是近年来研究的热点。TPL是中草药雷公藤主要活性成分的提取物，其衍生物PG490-88作为一种水溶性的衍生物，目前已经用于黑色素瘤等实体瘤的一期临床试验［6］。

本研究结果显示，TPL可抑制SU-DHL-4细胞增殖并诱导其凋亡，随着药物浓度增加，细胞的增殖抑制率明显增加，凋亡细胞增多，证实TPL具有抗DLBCL的活性。分析其作用机制可能为:①抑制抗凋亡蛋白表达，活化 Caspase级联反应［7～14］。本研究结果显示，TPL干预后相关抗凋亡蛋白XIAP和Mcl-1表达均呈浓度及时间依赖性降低;与凋亡密切相关的Caspase级联反应中的Pro-caspase8、Procaspase3表达亦呈浓度和时间依赖性降低;具有DNA损伤修复作用的Caspase3的底物PARP呈剂量与时间依赖性切割。②抑制增殖相关信号通路蛋白表达。研究发现，PI3K-AKT，MEK/ERK和JAKs/STATs信号转导通路与细胞增殖、分化及凋亡关系密切，通路的异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化［15～17］，本研究结果显示，TPL 干预后 P-AKT、PERK、P-STAT5表达水平下调与其总体蛋白水平的下调相比发生较早，提示这些信号通路活化受到TPL的抑制，进而导致细胞增殖抑制。关于这些通路是否与细胞凋亡蛋白表达直接相关以及TPL在体抗DLBCL生长的作用如何，还需进一步探讨与研究。

分析本研究结果，TPL可通过对凋亡相关蛋白及PI3K-Akt，MEK/ERK和JAKs/STATs信号转导通路的影响，抑制SU-DHL-4细胞生长，诱导其凋亡。本研究为DLBCL的治疗提供了新的策略与思路。

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