结直肠腺癌组织中FLNa、VEGF表达与微淋巴管密度的关系及意义

马红献，史建伟，张利众，刘勤英，李 中

(1 涞源县医院，河北保定 074300;2河北大学附属医院;3 保定市第一医院)

结直肠腺癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，局部复发和远处转移是患者预后较差的重要原因，淋巴道是转移的重要途径。细丝蛋白A(Filamin A，FLNa)是肌动蛋白结合蛋白家族成员之一，我们的前期研究表明其与结直肠腺癌的发生、发展密切相关［1］。本研究采用免疫组化法检测了FLNa、血管内皮生长因子(VEGF)和淋巴管特异性标志物D2-40在结直肠腺癌组织及正常结直肠组织中的表达情况，以进一步探讨 FLNa、VEGF的表达及微淋巴管密度(Lymphatic microvessel density，LMVD)与结直肠腺癌发生、发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本收集 标本为河北大学附属医院2005年1月～2006年12月结直肠腺癌手术切除癌组织(标本均取自肿瘤中心处)及其相应癌旁正常结直肠组织(标本取于距肿瘤边缘至少10 cm处)各46份。46例结直肠腺癌患者中男27例，女19例;年龄34～80岁，平均58岁。诊断均经病理证实，无其他部位原发肿瘤，术前无放、化疗及免疫生物治疗史。其中结肠腺癌17例、直肠腺癌29例，有淋巴结转移33例、无淋巴结转移13例，有肝转移9例、无肝转移37例，浸润深度达浆膜30例、未达浆膜16例。

1.2 FLNa、VEGF和D2-40的检测 ①免疫组化采用链霉亲和素—生物素—过氧化物酶检测步骤(免疫组化试剂盒及单克隆鼠抗人D2-40一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;单克隆兔抗人FLNa一抗购自Epitomics公司;单克隆鼠抗人VEGF一抗购自Santa Cruz公司):组织标本采用10%中性甲醛固定、石蜡包埋，切成4 μm厚切片，经脱蜡、水化，置入盛有枸橼酸缓冲液的容器内，于微波炉内(95℃，15 min)修复抗原，3%过氧化氢孵育20 min，PBS溶液冲洗，使用免疫组化试剂盒中的血清封闭，滴加兔抗人 FLNa一抗(1∶150)、鼠抗人 VEGF一抗(1∶100)和鼠抗人 D2-40一抗(1∶100)，4 ℃冰箱内过夜;PBS溶液冲洗，滴加免疫组化试剂盒内生物素标记的相关二抗，置于室温30 min;PBS溶液冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，置于室温30 min，PBS溶液冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木精染色、脱水，二甲苯透明，树胶封片。人子宫组织染色作为FLNa蛋白的阳性对照，人乳腺癌组织染色作为VEGF蛋白的阳性对照，人扁桃体组织染色作为D2-40蛋白的阳性对照，PBS溶液代替一抗进行染色作为阴性对照。②FLNa、VEGF表达及LMVD计数判定:FLNa和VEGF的阳性表达定位于细胞质，在高倍镜下选择5个视野计数，每个高倍视野下计数200个细胞，阳性细胞≤10%为1分、11% ～50%为2分、51% ～75%为3分，≥76%为4分;细胞质无色为0分、黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。上述两分值的乘积＞3分判为阳性，≤3分判为阴性。D2-40阳性表达定位于淋巴管内皮细胞的胞质和(或)胞膜，呈清晰棕黄色颗粒，用于标记并计数LMVD。LMVD计数采用Weidner等［2］的方法，先在40倍显微镜下观察整张切片的血管分布，选择脉管最密集的4个区域(热点区)，在200倍显微镜下观察，其中着色的细胞丛或单个细胞计为1条微淋巴管，取其均值为该组织切片的LMVD。由2名临床病理医师分别独立阅片，共同确定判定结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较用t检验、单因素方差分析，计数资料用χ2检验或Fisher确切概率法进行相关检验，相关关系分析用Spearman相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠腺癌组织及其癌旁正常组织中FLNa、VEGF的表达及LMVD 结直肠腺癌组织中FLNa阳性22例(47.83%)、VEGF 阳性41 例(89.13%)，癌旁正常组织中分别为 42例(91.30%)、15例(32.61%)，两种组织中FLNa、VEGF阳性表达率比较均有显著差异(P均=0.000);结直肠腺癌组织及其癌旁正常组织中的 LMVD分别为(17.32±2.12)、(4.36 ±1.21)条，P=0.001。

2.2 结直肠腺癌组织中FLNa、VEGF表达及LMVD与肿瘤临床病理参数的关系 结直肠腺癌组织中FLNa、VEGF的表达及LMVD值与有无淋巴结转移、肝转移及癌灶的浸润深度有关，而与年龄、性别及癌灶的部位无关，详见表1。

2.3 结直肠腺癌组织中FLNa、VEGF表达及LMVD三者间的相关性 结直肠腺癌组织22例FLNa表达阳性者中，VEGF表达阳性18例、阴性4例;24例FLNa表达阴性者中，VEGF表达阳性23例、阴性1例，FLNa和VEGF的表达水平呈显著负相关(r=-0.445，P=0.000)。FLNa 表达阳性和阴性者的 LMVD 分别为(3.24 ±0.57)、(16.23 ± 3.64)条，P=0.001;VEGF表达阳性和阴性者的LMVD分别为(15.65 ±1.26)、(2.94 ±0.61)条，P=0.000。

3 讨论

肿瘤微淋巴管与肿瘤生长、局部浸润及远处转移关系密切［3］。肿瘤细胞经淋巴管转移的具体机制尚不完全明确，但研究表明肿瘤细胞发生淋巴道转移时微淋巴管数量增多［4］。研究淋巴管内皮细胞的分子标志物包括VEGFR-3、Desmoplakin、LYVE-1、Podoplanin、D2-40、Prox-1 及 CD34等［5］。一项对比研究证实，D2-40对淋巴管内皮细胞具有较高的敏感性［6］。本研究中使用D2-40标记微淋巴管、检测LMVD，结果证实结直肠腺癌组织中的LMVD显著高于癌旁正常结直肠组织，并且与有无淋巴结转移、肝转移及癌灶的浸润深度有关。

表1 结直肠腺癌组织中FLNa、VEGF的表达及LMVD与肿瘤临床病理参数的关系

微淋巴管的形成及增殖受诸多因素的调节，多种血管生成促进因子可促进微淋巴管的生长，如VEGF、内皮素-1和碱性成纤维细胞生长因子等［7］。而内皮抑素、干扰素-α和血小板因子-4等可抑制淋巴管内皮细胞的增殖，促进其凋亡，从而抑制微淋巴管的生成［8］。对肿瘤微淋巴管生长进行抑制可有效阻遏肿瘤细胞经淋巴道扩散。FLNa是主要存在于细胞质的大分子蛋白，是细胞信号转导的支架蛋白，影响多种重要受体在细胞内的功能发挥，参与多条与肿瘤形成相关的主要信号转导通路，在肿瘤的形成及发展中具有重要作用［9］。VEGF是具有生物活性的糖蛋白，能促进血管内皮细胞的增殖、增强毛细血管的通透性，并诱导形成淋巴管［10］。Zhu等［11］发现，FLNa与VEGF结合经泛素化后可使VEGF降解。本研究发现，结直肠腺癌组织中的FLNa阳性表达率显著低于癌旁正常结直肠组织，而VEGF阳性表达率显著高于癌旁正常结直肠组织，两者均与肿瘤有无淋巴结转移、肝转移及癌灶的浸润深度有关，均与患者年龄、性别无明显相关;FLNa与VEGF在结直肠癌组织中的表达水平呈显著负相关，FLNa表达阳性者的LMVD显著低于FLNa表达阴性者，VEGF表达阳性者的LMVD显著高于VEGF表达阴性者。提示FLNa、VEGF的表达水平和LMVD与结直肠腺癌的形成、发展密切相关，其机制可能为FLNa通过下调VEGF的表达水平抑制肿瘤微淋巴管生长，最终抑制肿瘤细胞经淋巴道扩散。

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