卵巢上皮性肿瘤组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达变化及意义

由卫芝，申爱方，张 玲，赵新蕊

(聊城市人民医院，山东聊城 252000)

卵巢原发性恶性肿瘤中以上皮性癌最常见，占60% ～90%［1］，有关其发病机理及发生、发展的基因学说众多。DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)属于磷脂酰肌醇-3蛋白激酶(PI3KK)家族，与基因稳定性有较为密切的关系，DNA-PK的催化亚单位(DNA-PKcs)及调节亚单位(Ku70)共同参与DNA损伤修复途径［2］，此两个亚基异常表达均可能使生物体的基因组完整性和细胞稳定性遭到破坏，引起细胞增殖和分化失控，导致肿瘤的发生。本研究通过免疫组化法检测了DNAPKcs、Ku70蛋白在不同上皮性卵巢肿瘤组织中的表达情况，并分析了两者在卵巢肿瘤发生、发展中的意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 聊城市人民医院有完整临床和病理资料并行手术治疗的上皮性卵巢癌石蜡包埋组织标本共63份，组织标本获取时间为2008年1月～2011年12月。所有病例术前均根据诊治方案并在患者知情同意下未行放、化疗及激素治疗，均经病理检查确诊，患者年龄18～72岁。根据国际妇产科联盟FIGO2000年临床分期标准上皮性卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ 期22例，伴淋巴结转移22例，并发腹水28例;组织分化程度为中高分化43例，低分化20例;组织病理类型为浆液性腺癌40例，黏液性腺癌23例。随机选取同期良性上皮性卵巢肿瘤组织标本20份作为对照。

1.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的检测 组织石蜡切片厚度4 μm，常规脱蜡至水，采用高压煮沸法行抗原修复后按SP试剂盒(北京中杉生物技术有限公司提供)说明书检测DNA-PKcs、Ku70蛋白表达 。一抗试剂为DNA-PKcs兔抗人多克隆抗体、Ku70兔抗人多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)，均按说明书要求配制，工作浓度1∶300，DAB显色，苏木素对比染色。以PBS缓冲液代替一抗做阴性对照，每批切片免疫组化染色分析均以已知阳性组织切片做阳性对照。染色结果判定标准:随机选择5个高倍视野，计数500个以上细胞，均以胞核着色判断为阳性，对阳性细胞数及着色强度进行半定量，其中阳性细胞数为0计0分、1% ～30%计1分、31% ～70%计2分、71% ～100%计3分，细胞着色强度按照不着色、浅棕色、棕黄色、棕褐色依次计0、1、2、3分，上述两项评分之和0分为阴性、1～2分为弱阳性(+)、3～4分为中阳性(++)、5～6分为强阳性(+++)，阳性率按中阳性和强阳性计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包。率的比较用χ2检验，DNA-PKcs和Ku70蛋白表达的关系分析采用Spearman等级相关分析法。P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种不同上皮性卵巢肿瘤组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达 上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢肿瘤组织中DNA-PKcs蛋白的阳性表达率分别为68.25%(43/63)、15.00%(3/20)，二者差异有统计学意义(P＜0.05)。上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢肿瘤组织中Ku70蛋白的阳性表达率分别为76.19%(48/63)、20.00%(4/20)，二者差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系 DNA-PKcs蛋白表达与上皮性卵巢癌的病理学分级和手术病理分期相关(P＜0.05)，而与组织类型、腹水、淋巴结转移情况无关(P＞0.05)。Ku70蛋白的表达与上皮性卵巢癌的手术病理分期、病理学分级、腹水及淋巴结转移均相关(P ＜0.05)，与组织病理学类型无关(P ＞0.05)。详见表1。

表1 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系

2.3 上皮性卵巢癌组织中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表达的相关性 上皮性卵巢癌组织中DNAPKcs蛋白和Ku70蛋白表达呈正相关(r=0.619，P＜0.001)，详见表2。

表2 上皮性卵巢癌组织中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表达的相关性(例)

3 讨论

目前，卵巢癌发病原因不清，诸多研究表明多种基因在其发生中起协同作用［3］，DNA-PK因在DNA损伤修复中具有关键作用，近年来受到越来越广泛的关注。DNA-PK包括催化亚单位DNA-PKcs和结构亚单位Ku70、Ku80组成的异二聚体全酶［4］。Ku异二聚体是DNA双链断裂(DNA doublestrand break，DSB)进行非同源性末端连接(Nonhomologous end joining，NHEJ)修复时启动阶段必须的酶，而DNA-PKcs发挥催化酶的活性，二者结合共同参与DNA 损伤修复途径［5，6］。DNA 损伤修复启动修复机制，是一种抑制癌症发生的有效保护途径，能够使细胞免于凋亡或死亡。例如，对哺乳动物肿瘤细胞DNA所致损伤进行及时修复有助于肿瘤细胞免于死亡。研究表明，在恶性肿瘤中普遍存在DNA-PK表达变化，许多肿瘤细胞均可见DNA-PK复合物的高表达［7～9］。有研究认为，卵巢癌组织中细胞的DNA修复能力增强，DNA-PKcs在卵巢良性肿瘤组织中的表达低于卵巢癌组织［10］。本实验研究结果支持上述观点，提示DNA-PKcs可能通过抑制癌细胞凋亡在卵巢癌的发生、发展中起重要作用，此基因对于鉴别卵巢肿瘤的良恶性生物学行为有一定指导意义。为进一步深入了解不同卵巢组织中的DNAPKcs表达水平，本研究用免疫组化的方法进行检测，并结合临床病理参数进行分析，结果显示DNAPKcs与上皮性卵巢癌的分化程度及临床分期有关。提示DNA-PKcs的异常表达与肿瘤的恶性程度及进展有一定关系，此与Hosoi等［11］的研究结果一致。Ku70最早发现于多发性肌炎综合征患者自身抗原，是完成NHEJ途径DNA-PK的重要因子之一。由于其功能的多样性及复杂性，近年来与肿瘤的相关性研究逐渐引起关注。

Ku70的高表达与多种肿瘤的发生、发展有关。国内外研究发现，Ku70的表达水平在肿瘤及原发灶之间存在显著差异，明显强于正常组织，并与肿瘤的侵润性、分期和转移灶有关［12］。Economopoulou等［13］通过Western Blotting方法检测了Ku70在成人骨髓异常增生综合征组织中的表达，结果发现核型预后较好患者的Ku70表达率低;Mazzarelli等［14］发现，Ku70在正常直肠黏膜组织表达中较弱，在直肠癌组织中的表达显著增强。本研究显示，上皮性卵巢癌组织中Ku70蛋白的阳性表达率显著高于良性上皮性卵巢肿瘤组织，且其表达与上皮性卵巢癌组织学类型无关，与临床分期、病理学分级、腹水、淋巴结转移均有关，与诸多文献报道相似。表明Ku70的表达与上皮性卵巢癌的发生、发展及恶性程度相关，此在妇科其他恶性肿瘤中也有论证。张妍等［15］的研究表明，Ku70的表达与宫颈癌组织分化程度相关，Ku70蛋白高表达者组织分化程度差、恶性程度高，此亦表明Ku70的过度表达在肿瘤的进展过程中起一定作用。故检测Ku70蛋白表达对于间接判断肿瘤患者的治疗效果及预后可能有重要指导意义，下调Ku70蛋白的表达水平将成为抗癌治疗的新方向。本研究还显示，DNA-PKcs、Ku70在上皮性卵巢癌组织中的表达呈正相关。可能机制:DNAPKcs与Ku70均为DNA-PK的重要亚基，二者在细胞DSB修复过程中发挥重要的协同作用。

综上所述，DNA-PKcs、Ku70蛋白高表达可能在上皮性卵巢癌发生、发展及转移中发挥协同作用，且有可能成为上皮性卵巢癌早期诊断、预后判断的新指标及治疗靶点。

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