clock基因在脑胶质瘤组织中的表达变化

陈晓巍，王 凡，陈治军，刘平非，罗 勇，梁 武，夏鹤春

(1 荆门市第一人民医院，湖北荆门 448000;2 宁夏医科大学附属医院)

生物昼夜节律是一种基本的生命活动现象，广泛存在于从简单的单细胞生物到高等的哺乳动物之中［1，2］。其中最主要也最基本的分子机制是生物钟基因(clock)及其蛋白产物构成的自主调节的转录—翻译反馈回路，而clock基因则是该反馈通路中最为核心的元件［3，4］。近年研究发现，clock基因的表达异常可能会导致乳腺癌、小细胞肺癌、子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的发生［5］。2008年7月 ～2010年11月，我们检测了clock基因在脑胶质瘤细胞中的表达，探讨其与胶质瘤发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选择湖北省荆门市第一人民医院神经外科2008年7月～2010年11月手术切除的胶质瘤手术标本67份，以胶质瘤组织作为胶质瘤组，以瘤周的非瘤组织作为对照组。患者术前均未行放疗或化疗。根据2007年WHO分级和分类标准，胶质瘤组为Ⅰ～Ⅱ级36份(患者年龄35～58岁)、Ⅲ～Ⅳ级31份(患者年龄23～68岁)。Maxwell®16 Total RNA Purification Kit购自于美国Promega公司，逆转录试剂盒ImProm-IITM Reverse Transcription System购自美国Promega公司，PCR试剂盒购自天根公司，羊抗人clock及羊抗人PCNA一抗购自Santa Cruz公司，兔抗羊IgG抗体-HRP多聚体(PV-6002)和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 clock mRNA检测 采用RT-PCR法。将肿瘤及周边非瘤组织手术切除后立即浸泡于0.4%的DPEC溶液中，于无核酶条件下采用RNA提取试剂盒提取总RNA，取2 μg总RNA用反转录试剂盒合成cDNA，以2 μL cDNA为模板进行 PCR扩增，以hGAPDH为参照基因。clock基因序列为F:AGTTAGGGCTGAAAGACGACG，R:TTGCTTCTATCATGCGTGTCC，片段长度479 bp;hGAPDH序列为F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:AGGGGGCCATCCACAGTCTTC，片段长度266 bp。PCR反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;最后72℃延伸5 min。取PCR产物5 μL行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，置于Bio-Rad凝胶成像仪上成像，用Multi-Analyst软件进行结果分析，以clock条带灰度值/内参照条带灰度值的比值表示clock mRNA的相对表达量，每组实验重复3次。

1.2.2 clock及PCNA蛋白检测 采用免疫组织化学法。将两组石蜡标本制成10 μm厚切片，所有切片置于高压锅中，加热沸腾5 min进行抗原修复。完全冷却后，3%H2O2孵育15 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，3 min×3次，滴加一抗(clock抗体1∶400，PCNA 抗体1∶200)，4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗，3 min×3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，3 min×3次，DAB显色，苏木精复染、脱水封片，镜下观察。clock染色以细胞核出现黄色或棕褐色颗粒为阳性，PCNA(增殖细胞核抗原)以胞核及胞质中出现黄色或棕褐色颗粒为阳性。按阳性细胞所占比例及染色深度计分。阳性细胞比例≤24%为1分，25% ～50%为2分，51～75%为3分，≥76%为4分;无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者乘积0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，采用Pearson χ2检验、Fisher's确切概率法及 Spearman 秩相关分析法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 clock基因mRNA表达 胶质瘤组及对照组clock基因 mRNA表达量分别为 5.062±0.104、2.653 ± 0.091，P ＜0.01。胶质瘤组Ⅰ ～ Ⅱ级者clock基因mRNA表达与对照组比较无统计学差异(P＞0.05);Ⅲ～Ⅳ级者clock基因mRNA表达高于Ⅰ ～ Ⅱ级者(P ＜0.05)及对照组(P ＜0.05)。

2.2 clock蛋白表达 胶质瘤组及对照组clock蛋白阳性率分别为 70.20%(47/67)、52.23%(35/67)，P＜0.01。胶质瘤组Ⅰ ～Ⅱ级者、Ⅲ ～Ⅳ级者clock蛋白阳性率分别为 54.29%(19/35)、87.5%(28/32)，Ⅲ～Ⅳ级者clock蛋白阳性率高于Ⅰ～Ⅱ级者及对照组(P均＜0.05)。

2.3 PCNA蛋白表达 对照组PCNA蛋白无表达。胶质瘤细胞中PCNA阳性率100%，且Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中强阳性率(84.38%)明显高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织(48.57%)(P ＜0.05)。

2.4 clock与PCNA的相关性 胶质瘤组clock阳性表达与PCNA阳性表达呈正相关(r=0.273，P＜0.05)。见表 1。

表1 clock与PCNA表达的相关性

3 讨论

clock基因是生物钟基因中最为重要的调控因子，在生物节律系统的自动调整反馈循环中处于核心地位。clock基因参与了对节律控制基因的调控作用，而后者被认为广泛存在于机体各个生命活动中，其中包括细胞生长周期［6，7］。研究发现，clock 基因敲除小鼠体内的成纤维细胞的生长能力明显弱于野生型小鼠［8］。clock基因缺陷小鼠体内的淋巴组织具有明显的凋亡倾向［9］。乳腺癌患者癌组织中clock基因表达量明显高于非乳腺癌患者［10］。上述研究结果显示，clock基因可能是肿瘤发生的促进因子。本研究发现，胶质瘤组clock基因mRNA表达量高于对照组，且在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的表达高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤及对照组;clock蛋白的表达也存在统计学差异，胶质瘤组clock蛋白表达高于对照组，且在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的表达高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤及对照组，提示胶质瘤细胞可能与患者自身存在不同的昼夜节律。

PCNA为增殖细胞核抗原，与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动方面起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。本研究发现，胶质瘤细胞中PCNA阳性率100%，且Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中强阳性率(84.38%)明显高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织(48.57%)，clock蛋白与PCNA阳性表达呈正相关，提示clock蛋白的表达对肿瘤细胞的增殖状态存在促进关系。

结合文献我们认为，clock主要通过两方面影响了胶质瘤细胞的生长。一是影响细胞周期。由于人体内调节细胞周期的限速因子细胞周期蛋白绝大数受clock基因控制，有学者推测，clock蛋白可能是一种转录增强因子，通过调节细胞生长周期的重要基因来达到调节细胞周期的作用［11］。最近有研究表明，clock蛋白是一种组蛋白乙酰基转移酶，可以通过另外的潜在调节途径来影响细胞周期的进程［12］。二是失去了对clock基因的反作用因子。Per1、Per2是clock转录—翻译反馈通路中最为重要的反式作用因子［1～3］。研究发现，Per1、Per2 基因在胶质瘤组织中的表达明显低于瘤周组织，提示胶质瘤的起源与Per1、Per2基因的表达减弱密切相关［13］。我们推测在胶质瘤组织中Per1、Per2基因的表达减弱，使clock基因的转录负性因素减弱，破坏了正常转录—翻译反馈回路的运行，从而影响了细胞生长周期的正常运行。

尽管有关clock基因与胶质瘤发生发展的具体分子机制还尚未明确，但却为胶质瘤的临床治疗开辟了一条新的思路，为胶质瘤的生物治疗及基因靶向治疗提供了理论基础。

［1］Reppert SM，Weaver DR.Coordination of circadian timing in mammals［J］.Nature，2002，418(6901):935-941.

［2］Morse D，Sassone-Corsi P.Time after time:inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators［J］.Trends Neurosci，2002，25(12):632-637.

［3］Reppert SM，Weaver DR.Molecular analysis of mammalian circadian rhythms［J］.Annu Rev Physiol，2001，63(4):647-676.

［4］Panda S，Antoch MP，Miller BH，et al.Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock［J］.Cell，2002，109(3):307-320.

［5］Lee CC.Tumor suppression by the mammalian period genes［J］.Cancer Causes Control，2006，17(4):525-530.

［6］Gekakis N，Staknis D，Nguyen HB，et al.Role of the clock protein in the mammalian circadian mechanism［J］.Science，1998，280(5369):1564-1569.

［7］Matsuo T，Yamaguchi S，Mitsui S，et al.Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo［J］.Science，2003，302(5643):255-259.

［8］Miller BH，McDearmon EL，Panda S，et al.Circadian and clock controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(9):3342-3347.

［9］Antoch MP，Gorbacheva VY，Vykhovanets O，et al.Disruption of the circadian clock due to the clock mutation has discrete effects on aging and carcinogenesis［J］.Cell Cycle，2008，7(9):1197-1204.

［10］Aaron EH，Yi CH，Zheng TZ，et al.Clock in breast tumorigenesis:genetic，epigenetic，and transcriptional profiling analyses［J］.Cancer Res，2010，70(4):1459-1468.

［11］Young MW，Kay SA.Time zones:a comparative genetics of circadian clocks［J］.Nat Rev Genet，2001，2(9):702-715.

［12］Kalamvoki M，Roizman B.Circadian clock histone acetyl transferase localizes at ND10 nuclear bodies and enables herpes simplex virus gene expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(41):17721-17726.

［13］Xia HC，Niu ZF，Ma H，et al.Deregulated expression of the Per1 and Per2 in human gliomas［J］.Can J Neurol Sci，2010，37(3):365-370.