CGIMT在脑IR后BBB损伤大鼠脑组织超微结构及AQP4表达观察中的应用

彭拥军，王和生，孙建华，陈 理，许美娟，储继红

(南京中医药大学附属医院，南京 210029)

血脑屏障(BBB)［1］是一个复杂的细胞系统，由内皮细胞、内皮细胞的紧密连接、星形胶质细胞、周皮细胞和血管周围的小胶质细胞以及基底膜等结构组成并维持BBB的特殊功能。脑缺血—再灌注(IR)后BBB受到破坏，血液的成分(包括电解质和血浆蛋白)因血液压力而经开放的BBB释放入脑组织。水通道蛋白-4(AQP4)广泛分布于脑组织中星形胶质细胞的终足、脑室系统的室管膜、脑表面的软脑膜、脉络丛等与脑脊液直接相接触的组织中以及脑组织的血管周围，对脑组织中水分子的代谢平衡起主要调节作用［2，3］，且与 BBB 关系密切［4，5］。2012年5～9月 ，我们采用胶体金免疫电镜技术(CGIMT)对IR后BBB损伤大鼠脑组织超微结构及AQP4表达进行了观察，旨在从微观结构上观察脑IR变化。

1 材料与方法

1.1 材料 SD雄性大鼠18只(购自中科院啮齿类实验动物中心，清洁级)，体质量(220±10)g。兔抗AQP4抗体(购自美国Chemicon公司)，12 nm胶体金标记的羊抗兔IgG(购自美国Jackson公司)。

1.2 大鼠分组及处理 将18只大鼠随机分为对照组、模型组和电针组各6只。模型组和电针组均采用改良大脑中动脉栓塞(MCAO)方法［6］建立局灶性IR模型，缺血1 h，再灌注24 h，激光多普勒脑血流仪判断造模成功与否。电针组于MCAO造模成功后5 min开始电针“人中”、“百会”穴，时间30 min，采用疏密波，示波器监测电流强度在0.8～1.3 mA。对照组不做特殊处理。

1.3 脑组织振动切片制备 各组分别于IR后24 h，采用水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔、暴露心脏，左心室插管灌注固定，先以250 mL生理盐水快速冲洗，然后灌以500 mL含4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的免疫电镜灌注固定液;剥离鼠脑，置于4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的固定液中，4℃固定过夜;在Leica VT 1000S振动切片机上制备50 μm厚的冠状切片，置于冰晶保护液中4℃保存。

1.4 脑组织超微结构及AQP4表达观察 采用CGIMT。取上述50 μm厚的振动脑切片，铺平置于玻璃载玻片上，将液氮内小槽迅速提出，快速将脑片冻融(时间以脑切片的颜色变白为宜)，冻融后的切片重新放回原来的冰晶保护液内;0.01 mol/L PBS(pH值7.4)漂洗10 min×3次;置含10%灭活山羊血清的0.01 mol/L PBS中室温封闭1 h;加入兔抗鼠anti-AQP4抗血清(1∶100)，室温孵育 24 h;0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次;加入胶体金标记的羊抗兔IgG(1∶10)，室温孵育24 h;0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次;在切片缺血侧纹状体区切取一小块脑组织，置入含4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的免疫电镜灌注固定液中;置入含1%锇酸的0.01 mol/L PBS(pH 值 7.4)室温下锇化 45 min ～1 h，用双蒸水漂洗切片2次(每次10 min)，浸入50%乙醇脱水，用含1%醋酸铀的70%乙醇在避光条件下染色并脱水45 min～1 h，依次进行梯度乙醇脱水 (80%、90%、95%、99%、100%、100% 各10 min)，加入环氧丙烷(5 min×2次)，将切片放入环氧树脂中浸透16 h，包埋在硅化的玻片上，60℃下聚合48 h;在解剖显微镜观察下切取一小部分包埋后的切片，修块后进行超薄切片(厚50 nm)，将银白色或淡黄色的连续切片分别捞取到有支持膜的单孔铜网上，在透射电镜下观察并摄片。细胞内见黑色圆球颗粒判定为AQP4表达阳性。

2 结果

电镜下，对照组脑组织星形胶质细胞、神经细胞结构基本正常，神经元的细胞核完整，核仁、细胞膜结构清晰，染色质密度均匀，核仁明显;细胞器中可看到粗面内质网、线粒体和高尔基体等，BBB中的微血管内皮细胞层和基底膜结构基本正常，细胞间有紧密连接存在。电针组脑组织星形胶质细胞、微血管内皮细胞层和线粒体稍微肿胀，基底膜完整，紧密连接存在。上述两组AQP4均定位于微血管内皮细胞周围的胶质细胞终足上，呈低表达，见图1A、1B。

模型组星形胶质细胞萎缩，胶质细胞水肿，胞质蛋白和核蛋白组织松散、丢失，神经元细胞核常染色质疏松，异染色质不规则固缩并向核周边聚集，粗面内质网及线粒体肿胀，部分溶解;微血管内皮细胞出现核萎缩、变性，核染色质松散退变，胞饮小泡增多，血管管腔狭窄;星形胶质细胞突起肿胀，终足严重水肿;基底膜不完整，细胞间紧密连接多处开放，IR后内皮细胞间隙变大、通透性明显，胞质和间质水肿增多，毛细血管内皮细胞有多个呈伪足样向管腔内伸入突起;AQP4表达较上两组增多，见图1C、1D。

图1 三组免疫电镜超微结构(×160000)

3 讨论

IR损伤最显著的组织学变化是脑水肿和脑细胞坏死。脑水肿的发生机制尚未完全阐明，可能与细胞能量代谢障碍、脑微循环及BBB障碍、自由基损伤、钙超载、兴奋性氨基酸的毒性作用及AQP等因素有关［7］。迄今为止，在哺乳动物体内共发现13种AQP家族成员，其中AQP4为最重要的一种，参与胶质细胞与脑脊液及血管之间的水调节和运输，与脑脊液重新收、渗透压调节及脑水肿形成的生理、病理过程密切相关［8］。正常情况下AQP4呈低表达、脑缺血时表达增多，检测AQP4表达对判定IR损伤程度具有重要意义［9］。

CGIMT是利用电子显微镜在超微结构水平上研究免疫反应的一项新技术，主要机制是用电子致密物质胶体金(直径在1～150 nm)标记抗体，使其与含有相应抗原的生物标本反应，通过电镜观察电子致密物质所在位置，从而识别抗原、抗体反应的部位。由于电子显微镜的分辨力很高，故可准确地显示抗原所在部位。该技术是一种在分子水平上的抗原定位法，实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的原理应用到分子水平上。此项技术是细胞抗原成分定位、识别以及细胞形态和功能关系研究中的重要方法，主要用于病毒及细菌等抗原定位、免疫性疾病发病机理及超微结构免疫细胞化学的研究等［10］。其主要优势:①操作相对简便，不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少;②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别;③利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，利于研究突触小泡内神经递质共存情况;④根据抗、原抗体反应部位结合金颗粒数量多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究;⑤金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。

本研究采用CGIMT检测了IR损伤后的脑组织超微结构变化及AQP4分布情况，结果显示:对照组和模型组脑组织超微结构基本正常、AQP4低表达;模型组胶质细胞萎缩，核蛋白和胞质蛋白成分松散、丢失，粗面内质网致密，AQP4表达增多。表明IR损伤后神经元发生凋亡坏死的同时，胶质细胞也发生类似变化;包绕微血管的胶质细胞的足突比微血管对缺血更为敏感，最早发生肿胀和退行性变，并势必影响BBB的营养传递功能;血管周围的胶质细胞突起是水分子流动的主要部位。值得注意的是，常规CGIMT中，为使金探针容易透过细胞膜标记细胞内抗原，常应用TritonX-100，但后者极易使细胞膜受到破坏。本研究利用液氮将脑切片快速冻融，以增强抗体的渗透性，结果显示12 nm的金探针准确地标记在细胞内抗原存在的部位，电镜下膜结构保存良好。说明液氮内将脑切片进行快速冻融不但可增加胶体金标记的敏感性，还能使膜结构不受破坏。此外，固定剂的选择亦非常关键，主要条件:①不损害细胞内抗原的活性;②固定速度快、效果好;③相对分子质量小，易于渗透;④固定后不会引起交联而造成空间阻碍，从而影响标记抗体进入抗原位。本研究选用4%多聚甲醛、0.075% ～0.1%戊二醛作为固定剂，均满足以上几点要求。

综上所述，CGIMT能较好的保存细胞的超微结构和抗原活性、准确显示AQP4表达部位，可用于IR损伤后脑超微结构变化的研究。

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