两种乳酸菌发酵液对人胃癌细胞株BGC823体外增殖及小鼠免疫功能的影响

牛 琼，马 云，杜镇镇，张 珍

(1 滨州医学院临床学院，山东滨州 256603;2 滨州医学院病原免疫实验室)

乳酸菌(LAB)是人体消化道及生殖道内的一组正常菌群，有助于维持微生态的平衡与健康，其发酵碳水化合物过程中产生的酸性代谢产物、胞外多糖、γ-氨基丁酸等具有提高机体免疫力、抗感染、抗肿瘤等作用［1］。早在 20 世纪 80 年代，Oda等［2］即发现瑞士乳杆菌约古特亚种产生的胞外多糖(EPS)具有抑制肿瘤活性的作用;张筠等［3］亦报道保加利亚乳杆菌EPS对人癌细胞有抑制作用，但有关LAB发酵液(各种代谢产物混合体)的抑癌作用鲜见报道。2012年1～4月，我们观察了LAB发酵液对人胃癌细胞株BGC823体外增殖及小鼠免疫功能的影响，旨在为肿瘤防治提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 ①菌种与细胞株:保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb.)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，St.)、MRS 培养基，均购于北京北纳创联生物研究所;人胃癌BGC823细胞株购于烟台大学药学院。②动物:昆明系小鼠、Balb/c小鼠、豚鼠(雌雄兼用)，均购于山东大学动物中心。③仪器:包括电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);气浴恒温振荡器(江苏荣华仪器);全自动高压灭菌器(日本三洋电器);生物安全柜(上海博迅实业);细胞培养箱、全自动酶标仪、离心机(均为赛默飞世尔科技公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 LAB的培养与发酵液的制备 将 Lb.和St.两种菌株分别用MRS液体培养基连续活化3代，用无菌PBS缓冲液洗涤细菌，调整密度为3×108mL。按2%体积量向MRS液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵;1周后，取发酵液以4000 r/min离心30 min，对上清用0.2 μm的微孔滤膜过滤器过滤除菌，调节pH值至7.2，分装冻存备用［4］。

1.2.2 人胃癌BGC823细胞增殖活性测定 取对数生长期BGC823细胞随机分为Lb.组、St.组、混合组和对照组，均按5×105/mL的密度接种于96孔板中，每孔均加入RPMI-1640细胞培养液(含10%胎牛血清)100 μL，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，去除上清;前三组分别加入Lb.发酵液、St.发酵液及两者1∶1混合发酵液各200 μL(发酵液与细胞培养液按1∶4体积比)，对照组加入PBS缓冲液200 μL(与细胞培养液体积比同上)，继续培养24、48、72 h后，每孔加入四氮唑蓝(MTT)溶液10 μL，4 h后洗弃上清、加二甲基亚砜150 μL［5］，每组至少6 个平行孔，用酶标仪测定570 nm波长处各组的光密度(OD)值。

1.2.3 小鼠迟发型超敏反应(DHT)实验及脾脏质量、指数检测 ①DHT实验:取40只昆明系小鼠随机分为Lb.组、St.组、混合组和对照组各10只，前三组分别予Lb.发酵液、St.发酵液、两菌1∶1混合发酵液及生理盐水灌胃，0.8 mL/次、1 次/d ×8 d，第 3天在小鼠左足垫注射0.5%的绵羊红细胞悬液0.2 mL，第7天用游标卡尺测量小鼠的左足垫厚度并再次注射0.5%的绵羊红细胞悬液0.2 mL，第8天(攻击24 h后)测定左足垫的厚度，取两次足垫厚度差值作为DHT指标［6］。②脾脏质量、指数检测:取DHT实验完毕小鼠，逐个称重，眼球放血致死，解剖取脾脏称重，计算脾脏指数［脾脏质量(mg)/体质量(g)］［7］。

1.2.4 脾细胞产生抗体溶血素检测 取40只Balb/c小鼠随机分为 Lb.组、St.组、混合组和对照组各10只，同上灌胃，连续7 d;第7天开始腹腔注射0.5%绵羊红细胞0.2 mL进行免疫，连续7 d，末次注射40 min后自眼球取血，3000 r/min离心5 min，将血清稀释100倍后取0.5 mL与1%绵羊红细胞和1∶30补体(豚鼠血清)各0.5 mL混合，在37℃恒温箱中反应30 min、0℃冰浴30 min终止反应;离心取上清，在540 nm波长处测OD值，用生理盐水加入补体反应体系作空白对照。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计量数据以表示，组间均数比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组BGC823细胞增殖活性 Lb.组、St.组、混合组不同时点BGC823细胞增殖活性均略低于对照组，其中混合组略低于Lb.组、St.组，但组间比较均无显著差异。详见表1。

表1 各组BGC823细胞增殖活性比较(OD值，)

表1 各组BGC823细胞增殖活性比较(OD值，)

BGC823组别 细胞增殖活性24 h 48 h 72 h Lb.组0.409 ±0.022 0.667 ±0.013 0.780 ±0.022 St.组 0.412 ±0.021 0.680 ±0.017 0.764 ±0.018混合组 0.396 ±0.037 0.653 ±0.023 0.746 ±0.009对照组0.428 ±0.013 0.678 ±0.021 0.802 ±0.017

2.2 各组免疫功能指标 见表2。

3 讨论

表2 各组免疫功能指标比较()

表2 各组免疫功能指标比较()

注:与对照组相比，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01

组别 足垫厚度差值(mm) 脾脏质量(mg) 脾脏指数 抗体溶血素(OD值)Lb.组 0.23 ±0.04* 0.121 ±0.009* 6.05 ±0.80* 0.341 ±0.023*St.组 0.24 ±0.01* 0.122 ±0.012* 6.35 ±1.07* 0.362 ±0.019*混合组 0.24 ±0.03* 0.127 ±0.010* 6.55 ±0.92* 0.405 ±0.035Δ对照组 0.21 ±0.01 0.118 ±0.011 5.90 ±0.95 0.336 ±0.027

胃癌是人类常见的肿瘤，目前基本采取以手术为主的综合治疗方法，但易于复发或转移、预后较差［8］。如何运用天然食物或人体肠道有益菌及其代谢产物进行肿瘤的防治为目前国际上的重点研究课题。LAB在调节肠道微生态学中具有重要的地位，目前在轻工、食品、医药及饲料等许多行业都有广泛的应用，其发酵液具有制备简单、安全性高、毒副作用小等优点［1］。刘宇［9］报道，LAB 代谢产物 EPS体外对胃癌、肠癌细胞均有明显抑制作用，且剂量、时间与效应呈正相关。本研究显示，Lb.组、St.组、混合组不同时点BGC823细胞增殖活性均略高于对照组，其中混合组略低于Lb.组、St.组，但组间比较均无显著差异。可能原因为本研究所用发酵液中对胃癌细胞具有增殖抑制作用的成分含量或浓度太低，以后研究需浓缩发酵液，进一步明确各成分及其作用机理。

DHT是抗原诱导的一种细胞性免疫应答，即效应T细胞与特异性抗原结合作用后，引起的以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应［10］，此超敏反应因发生较慢，通常在接触相同抗原后24～72 h出现炎症反应而得名，广泛用来测定活体内的细胞免疫水平，评估免疫系统的能力。脾脏为机体最大的免疫器官(与免疫力的产生密切相关)，含有大量免疫细胞，其中T淋巴细胞约占40%、B淋巴细胞约占60%，脾脏质量与指数同时增加对细胞免疫和体液免疫均有促进作用，即表明机体免疫功能增强［11］。脾细胞抗体溶血素水平是反映体液免疫的一项常用指标，其发生机制如下:绵羊红细胞作为一种较强的抗原性异物，注入小鼠腹腔后其淋巴细胞便产生相应的抗体溶血素，并释放至外周血;取小鼠血清与绵羊红细胞一起温育，并在补体参与下可以产生溶血现象;测其上清液的OD值可间接判断血清中抗体形成的数量，OD值越大，则表明抗体产生量越多［12］。顾笑梅等［13］报道，LAB 发酵液提取的EPS可明显增强荷瘤小鼠的免疫功能。本研究显示，Lb.组、St.组及混合组的足垫厚度差值、脾脏质量、脾脏指数、抗体溶血素水平均显著高于对照组，其中混合组抗体溶血素水平升高尤为明显。提示保加利亚乳杆菌发酵液、嗜热链球菌发酵液及其混合液均能显著改善小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。可能机制为两种发酵液具有下列特点:①含有EPS、γ-氨基丁酸等多种免疫调节成分，可刺激B细胞分化增殖转变为浆细胞，促进特异性抗体的产生;可通过刺激效应T细胞的分化、增殖增强细胞免疫功能，因T细胞有表面分化抗原CD3+、CD4+、CD8+多个亚群，需进一步明确CD4+/CD8+以明确其免疫力提高的机制。②混合发酵液中免疫调节成分更为全面，能弥补单一菌种分解不同糖类的不足，将不同菌种依最适组合、比例调配制成复合的发酵剂菌种有望提高产品的质量和效果［1］。

综上所述，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌发酵液对胃癌细胞增殖的直接抑制效果不明显，但对小鼠的细胞免疫与体液免疫均具有增强作用;此研究有望为肿瘤防治提供新思路。

［1］孟祥晨，杜鹏，李艾黎，等.乳酸菌与乳品发酵剂［M］.北京:科学出版社，2009:93-126.

［2］Oda M，Hasegawa H，Komatsu S，et al.Anti-tumor polysaccharide from Lactobacillus sp［J］.Agric Biol Chem，1983，47(7):1623-1625.

［3］张筠，刘宁，孟祥晨.保加利亚乳杆菌胞外多糖对人癌细胞抑制作用的研究［J］.中华预防医学杂志，2007，41(3):238-239.

［4］张玉梅，房卫刚，李波清，等.红茶菌发酵液抑菌作用研究［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(12):890-891.

［5］邹少娜，袁智子，胡倩云，等.表没食子儿茶素没食子酸酯对人胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响［J］.山东医药，2012，52(46):8-11.

［6］廉宜君，李炳奇，肖芙蓉，等.沙枣多糖对小鼠免疫功能影响的研究［J］.时珍国医国药，2009，20(5):1126-1127.

［7］毛讯.麦冬天冬提取物对糖尿病小鼠空腹血糖及胸腺、脾脏指数的影响［J］.中国老年学杂志，2010，30(13):1861-1862.

［8］邹小农，孙喜斌，陈万青，等.2003-2007年中国胃癌发病与死亡情况分析［J］.肿瘤，2012，32(2):109-114.

［9］刘宇.保加利亚乳杆菌胞外多糖诱导人胃癌细胞凋亡的作用与机制［D］.东北农业大学，2007.

［10］金伯泉，熊思东.医学免疫学［M］.5版.北京:人民卫生出版社，2009:185-186.

［11］朱志中，颜培宇，唐强，等.针刺结合康复训练对免疫抑制大鼠脾脏指数及血清IL-2的影响［J］.中医药学报，2010，38(3):91-94.

［12］丁晓红，孙远岭，周纬，等.运脾方对小鼠血清溶血素抗体生成作用的影响［J］.中国中医药信息杂志，2009，16(9):27-28.

［13］顾笑梅，孔健，王富生，等.一株乳酸菌所产胞外多糖对荷瘤小鼠机体免疫功能的研究［J］.微生物学报，2003，43(2):252-256.