卡维地洛灌胃对大鼠胃缺血再灌注损伤的疗效及其作用机制

高 秋，杨 松，赵祥海，季燕妮，周 维

(宜兴市人民医院，江苏宜兴 214200)

近年来一氧化氮(NO)和氧化应激在胃黏膜病变过程中的作用日益受到关注［1，2］。卡维地洛属于第三代β受体阻断药，具有α和β受体阻断、抗细胞增殖及细胞保护等作用［3］;此外，其对心肌缺血、肾缺血引起器官损伤的保护作用逐渐得到阐明［4，5］，但其对胃缺血再灌注(GI/R)损伤的作用鲜见文献报道。本研究观察了卡维地洛对GI/R损伤大鼠胃黏膜损伤指数(GMDI)及胃黏膜组织中髓过氧化物氧化酶(MPO)活性、NO含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及凋亡执行蛋白Caspase-3的表达的影响，以探讨卡维地洛对大鼠GI/R损伤的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及试剂 ①动物:普通级雄性SD大鼠40只，体质量220～240 g，购自徐州医学院实验动物中心，动物合格证号:SCXK(苏)2003-0003。实验前24 h禁食，自由饮水，室温(23±2)℃。②药品和试剂:卡维地洛(山东齐鲁制药有限公司);SOD试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒、MPO试剂盒、苏木素伊红(HE)染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体购自Cell Signaling;BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白质分子量标准、Western blot封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液和BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。其他均为AR级化学试剂。③实验仪器:高速匀浆机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司);751G-可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂);IX71光学显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社);Bio-Rad model 680酶标仪及Bio-Rad电泳仪(美国 Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及卡维地洛应用 将25只SD大鼠随机分为5组，各5只。卡维地洛低、中、高剂量组:分别予卡维地洛30、60、90 mg/kg灌胃，1次/d，连续5 d，末次给药前24 h禁食，末次给药后60 min采用Zhang等［6］方法制备GI/R损伤模型，即以动脉夹夹闭大鼠腹腔动脉30 min后再灌注1 h。模型组:仅夹闭腹腔动脉制备GI/R损伤模型;假手术组:仅开腹90 min，未夹闭腹腔动脉。

1.2.2 GMDI测定 取各组大鼠断头处死，剖腹，取出胃后沿大弯处剪开，用冰生理盐水冲洗，在冰盘上展开，置方格计数板(每一方格面积为1 mm2)，以局限于胃腺上皮的点状糜烂、溃疡和出血灶的长度累计积分:正常为0分，损伤长度≤1 mm计1分、≤2 mm计2分，其余类推;损伤宽度超过1 mm时加倍计分，取各组计分平均值作为GMDI。

1.2.3 胃黏膜组织形态学观察 GMDI测量完毕后，于冰盘上剪开胃，取1/2胃黏膜置于-80℃保存待用;1/2置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水、石蜡包埋，5 μm切片，HE染色。采用双盲法，在奥林巴斯光学显微镜下观察胃组织形态学变化。

1.2.4 胃黏膜SOD、MPO活性及NO、MDA含量的检测 取胃黏膜于冷生理盐水中匀浆，按试剂盒方法进行操作，采用比色法检测SOD、MPO活性及NO、MDA含量。

1.2.5 胃黏膜Caspase-3蛋白的检测 采用Western blot法。取100 μg细胞总蛋白置于10%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后电转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭;将膜置于一抗中4℃ 摇床过夜，置于二抗液内室温下孵育1 h;TBS洗膜3次，置BCIP/NBT显色液显色;扫描蛋白印迹显影图，利用Image J软件计算目的蛋白表达的灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量数据以表示，组间比较采用One-way ANOVA分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠GMDI 卡维地洛低、中、高剂量组GMDI分别为90.4 ±10.4、64.7 ±14.6、52.1 ±9.6，模型组和假手术组 GMDI分别为 136.1±19.5、2.1±0.9。与假手术组相比，余四组 GMDI均显著升高，P均＜0.01;卡维地洛低、中、高剂量组GMDI均显著高于模型组，P 分别 ＜0.05、0.01 及0.01。

2.2 各组胃黏膜组织形态学变化 假手术组胃黏膜未发现病理学变化;模型组胃黏膜有糜烂、出血，局部腺体结构紊乱，间隙扩大，并有局部细胞脱落及淋巴细胞浸润;卡维地洛高剂量组胃黏膜上皮基本完整、连续，腺体排列较整齐，淋巴细胞浸润减少，且胃黏膜充血较轻微。

2.3 各组胃黏膜组织中 SOD、MPO活性及MDA、NO含量 与假手术组相比，模型组MDA、NO含量均明显升高，SOD活性显著降低、MPO活性显著升高;与模型组比较，卡维地洛低、中、高剂量组胃黏膜组织中的MDA、NO含量均显著减少，SOD活性明显增加、MPO活性显著降低。详见表1。

表1 各组胃黏膜组织中SOD、MPO活性及MDA、NO含量比较()

表1 各组胃黏膜组织中SOD、MPO活性及MDA、NO含量比较()

注:与假手术组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，ΔP ＜0.01

*卡维地洛低剂量组 122.31 ±279.12 5.35 ±1.09# 4.72 ±1.20# 3.31 ±1.23#卡维地洛中剂量组 145.20± 28.67# 4.86±1.41Δ 3.78±1.14Δ 2.93±0.65#卡维地洛高剂量组 152.53± 25.36Δ 4.43±0.97Δ 2.95±1.47Δ 2.21±0.62#假手术组168.30 ± 32.47 3.47 ±1.17 2.41 ±0.97 2.73 ±0.57

2.4 各组胃黏膜组织中Caspase-3蛋白表达 卡维地洛低、中、高剂量组胃黏膜组织中Caspase-3蛋白的表达量分别为0.42 ±0.06、0.37 ±0.04、0.26 ±0.03，模型组和假手术组分别为0.63 ±0.15、0.19 ±0.02。与假手术组比较，模型组胃黏膜组织中Caspase-3表达明显升高，P＜0.01;与模型组比较，卡维地洛高剂量组Caspase-3蛋白表达显著降低(P＜0.01)。

3 讨论

GI/R损伤是各种术后并发症的重要诱因，严重威胁人类的健康。GI/R可导致大量氧自由基生成，使胃黏膜组织脂质过氧化，进而激活组织细胞凋亡坏死，引起胃黏膜损伤［7］。本研究显示，模型组及卡维地洛各组GMDI均显著高于假手术组，且胃黏膜有糜烂、出血、局部腺体结构紊乱及淋巴细胞浸润等表现。提示模型组及卡维地洛各组存在GI/R损伤。NO为重要的胃黏膜保护因子，文献报道其胃黏膜保护活作用与增加胃黏膜血流量有关［8］。但近年研究［1］显示，GI/R 条件下，胃黏膜组织中诱导型一氧化氮合酶活性增高，造成NO水平急剧增高，过度生成的NO可直接引起细胞毒作用或通过自由基氧化生成毒性更大的强氧化剂，导致能量代谢障碍使细胞死亡。卡维地洛在治疗剂量范围内，兼有α1和非选择性β受体阻滞作用，其对心肌、肾缺血所致器官损伤的保护作用已有报道。本研究显示，大鼠GI/R损伤后胃黏膜组织中NO含量及MPO活性均显著升高，与文献报道相一致［1］;卡维地洛各组NO含量及MPO活性均显著低于模型组。提示卡维地洛可抑制大鼠GI/R引起的胃黏膜损伤，且可抑制胃黏膜组织淋巴细胞浸润所致NO的过量生成。

文献报道，大量氧自由基可使器官组织的细胞脂质过氧化，促使胃黏膜组织细胞凋亡［7］，而卡维地洛具有较强的自由基清除作用［4］。本研究发现，大鼠GI/R损伤后胃黏膜组织中MDA含量显著增加、SOD活性显著降低，且卡维地洛各组MDA含量均显著低于模型组、SOD活性均显著高于模型组;模型组胃黏膜组织中Caspase-3表达明显高于假手术组，但明显低于卡维地洛高剂量组。证实卡维地洛可通过抑制GI/R损伤胃黏膜组织MDA含量增加及上调SOD活性发挥抗氧化应激作用，并可显著抑制GI/R损伤胃黏膜组织Caspase-3表达的上调。

综上所述，卡维地洛可减轻大鼠GI/R所致胃黏膜损伤，其机制与减少胃黏膜组织NO过量生成、抑制氧化应激、减轻胃黏膜组织细胞凋亡有关。

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