一株干酪乳杆菌ZW-63A产高光学纯L-乳酸的发酵优化研究

吴再强，邹慧斌 ，季更生，张汝兵，咸 漠

(1.江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏镇江212018;2.中科院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛266101)

乳酸的构型可以分为L－乳酸、D－乳酸和DL－乳酸［1］，广泛应用于食品、医药、轻纺、化工和环保等领域［2］。近年来，利用高品质的L－乳酸聚合生产的生物可降解塑料及医疗活性材料正被迅速推广应用［3］，向世界展示了L－乳酸的巨大发展前景。由于我国在L－乳酸的质量和产量上都不能满足市场日益增长的需求，且产品多为消旋的 DL－乳酸，品质较低［2］，因此对L－乳酸的工业发酵工艺进行优化研究，对于提高我国 L－乳酸的产量和品质具有重要的意义［2－4］。秦浩等［2］以乳酸菌 G－02为出发菌株，采用 DES和NTG诱变处理，采用高温高糖培养基进行筛选，最后获得一株L－乳酸菌G－04，在摇瓶发酵条件下发酵液中可积累L－乳酸151g/L。高年发等［5］以野生型乳酸乳杆菌干酪亚种进行发酵，乳酸产量最高为143.8g/L。但他们都没有对L－乳酸进行光学纯度分析。Se－Kwon Moon［10］等筛选得到一株 Lactobacillus paracasei subs p.paracasei CHB2121，经过发酵优化后，L－乳酸的光学纯度达到96.6%。本实验研究了一株干酪乳杆菌的种子培养方式、中和剂添加方式和培养基组等对L－乳酸产量和光学纯度的影响，旨在为工业化生产L－乳酸发酵工艺的进一步优化提供一定的借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ZW－63A 中国科学院青岛生物能源与过程研究所生物基化学品团队筛选，选育与保藏;葡萄糖、乙酸钠、碳酸钙、吐温－80等试剂 均是分析纯，国药集团;蛋白胨、酵母粉 OXOID公司;L－乳酸标样 山东省科学院。

Cary 50 UV－Vis型紫外分光光度计 Varian公司;GSP－9080MBE型隔水式恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;6－16型台式高速离心机Sigma公司;SW－CJ－1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;SBA－40D生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;DHG9076A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;ZHWY－1102C双层小容量恒温摇床 上海智诚公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵工艺最优工艺参数的确定 在做单因素实验时，依次改变葡萄糖、酵母粉、乙酸钠和磷酸二氢钾的添加量，同时改变种子培养方式、碳酸钙添加方式以及改变装液量，在单因素实验中，每个梯度都设置三个平行的摇瓶实验，取三个平行实验的平均值作为测量结果，以L－乳酸产量和菌体OD值为评价指标进行实验分析。通过前面的单因素实验结果分析，最后确定葡萄糖、酵母粉和乙酸钠三个因素设计三因素三水平的响应面分析实验［6－8］，实验设计中的水平和编码见表1。

表1 Box－Behnken设计各因子及其编码值Table 1 Each variable at different levels in Box－behnken design

1.2.2 响应面模型的分析验证 将响应面优化后的最佳结果进行实验验证［6］，在最优的发酵条件下，设置三个平行的摇瓶的实验，首先用 Design－Expert 8.0.7软件将优化实验数据与响应面模型进行拟合，得到拟合二次多项式回归方程，对该模型进行回归方程分析和方差分析，确定出其极值点以及取得极值相应自变量的取值，按照模型优化出来的最优工艺参数进行发酵验证实验，以验证模型的可靠性，并确定最后的优化结果［7－8］。

1.2.3 乳酸的分析方法 L－乳酸含量的测定时，先将发酵液混匀，移取100μL的发酵液稀释到500倍，10000r/min离心1min，采用生物传感分析仪测定，将三个平行的摇瓶实验测定后取其平均值;乳酸的光学纯度用高效液相色谱法(手性分离柱)进行测定，首先移取100μL混匀的发酵液稀释至100倍，然后用0.22μm的滤膜过滤，乳酸光学纯度测定条件:采用Sumichiral OA－5000 4.6mm×150mm手性分离柱，流动相为2mmol/L CuSO45%异丙醇，流速为1mL/min，柱温 35℃，紫外检测波长 236nm［10］。

1.2.4 菌体浓度的测定 先将发酵过后的发酵液室温下静置30min，移取发酵液中的上清液100μL稀释至50倍，利用分光光度计在波长600nm处测定菌体的 OD 值［9－10］，将三个平行的摇瓶实验的样品测定后取其平均值作为OD值的测定结果，发酵液中菌体的总OD值=OD600×稀释倍数。

1.3 数据统计分析

所有实验均进行3次重复，取其平均值，平均值和标准偏差的统计分析由Microsoft Excel 2010软件进行处理。除响应面分析外的绘图由Origin 8.5软件统计分析实验数据完成。响应面数据分析采用统计分析软件Design－Expert 8.0.7。

2 结果与分析

2.1 确定种子培养方式与接种时间

如图1所示，种子的培养方式一定程度上会影响菌体浓度，本实验采取以下四种培养方式:静置培养;振荡培养;静置12h再振荡培养;振荡12h再静置培养。由图1可以看出，采取静置12h再振荡培养的菌体浓度最高，并且在培养到20h时菌体浓度达到最高，在16～20h菌体进入对数生长期，20h之后菌体浓度变化不大，菌体已进入稳定期，为了减少菌体接种到发酵培养基中培养的延迟期，同时为了保证接入发酵培养的种子的活力，防止菌种衰亡老化，选择将种子培养到18、20、22h分别接入到发酵培养基中，结果如图2所示。其中选择将种子培养到20h时，乳酸产量最高，菌体浓度最低，葡萄糖消耗量最多，而培养到18h接种时，菌体浓度最高，乳酸产量最低，说明高密度发酵不利于乳酸的产生，因此，种子的培养方式采取先静置再振荡培养的方式(静置12h+振荡8h)最佳。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 不同碳源及其浓度对乳酸发酵的影响 碳源是产物乳酸的最终骨架结构来源，由图3所示，葡萄糖作为碳源时乳酸产量明显高于蔗糖和麦芽糖的，蔗糖和麦芽糖对L－乳酸发酵影响相差不大，因此选择葡萄糖作为乳酸发酵的最佳碳源。碳源浓度的大小也会对乳酸发酵产生影响，初始发酵培养基中葡萄糖浓度的大小一定程度上决定了乳酸的产量［11］，由图4所示，当装液量为100mL，葡萄糖添加量为16g时，乳酸产量最高，大于16g时乳酸产量反而下降，可能是由于过高的葡萄糖浓度致使发酵液的渗透压增大，使得菌体不能够较好的生长繁殖和进行正常的新陈代谢，从而导致最终菌体生长的浓度过低和乳酸产量过低。

图3 不同碳源对L－乳酸发酵的影响Fig.3 Effect of different carbon sources on L－lactic acid fermentation

图4 初始葡萄糖添加量对L－乳酸发酵的影响Fig.4 Effect of different glucose concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.2 碳酸钙添加方式对乳酸发酵的影响 由于在乳酸发酵过程中菌体不断向外环境产生大量的L－乳酸，造成发酵液中酸性过大，能够抑制后续乳酸的产生［12］，为了研究碳酸钙的添加方式对乳酸发酵的影响，设计了四种不同碳酸钙添加方式对乳酸发酵影响的实验，4种方式分别为:不加碳酸钙;一次性添加10g碳酸钙;首先添加5g碳酸钙培养1d后再添加5g碳酸钙;首先添加5g碳酸钙培养2d后再添加5g碳酸钙。结果如图5所示，选择发酵培养前一次性添加10g碳酸钙，菌体浓度最高以及乳酸产量也是最高，而不加碳酸钙时乳酸产量明显低于添加碳酸钙的乳酸产量，说明添加碳酸钙对促进乳酸产量的提高具有很大作用，因此选用过一次性添加10g碳酸钙的添加方式不仅可以减少操作工序，还能够提高发酵速度，在发酵过程中需要振荡，以使碳酸钙能够充分中和乳酸［12］。

图5 不同碳酸钙添加方式对L－乳酸发酵的影响Fig.5 Effect of different calcium carbonate on L－lactic acid fermentation

2.2.3 不同装液量对乳酸发酵的影响 由图6可以看出，当装液量为100mL时，乳酸产量最高，可能是当装液量太少时，溶氧过多不利于厌氧发酵乳酸的产生，当装液量太多时由于底层的碳酸钙粉末不能与产生的乳酸充分中和，从而使乳酸的积累对发酵生产乳酸起到了抑制作用。

图6 不同装液量对L－乳酸发酵的影响Fig.6 Effect of different liquid medium volume on L－lactic acid fermentation

2.2.4 不同氮源及其氮源浓度对乳酸发酵的影响［11－14］向发酵培养基中加入不同的氮源，分别为蛋白胨、酵母粉、蛋白胨+酵母粉，三种不同的氮源，装液量为100mL，当氮源加入量相同，37℃摇床厌氧发酵96h，通过图7结果所示，酵母粉作为单一氮源时，乳酸产量反而高于蛋白胨+酵母粉的混合氮源，当只加蛋白胨时乳酸产量明显低于其它两种方式，而且通过图7可以看出蛋白胨作为氮源时菌体生长的OD值明显低于其它两种培养方式，可能是高浓度的氮抑制了菌的生长和乳酸的产生。由于只加酵母粉作为氮源乳酸产量和OD值都高于蛋白胨+酵母粉的添加方式，且只添加酵母粉还能够解决经济成本，因此选用酵母粉作为氮源发酵生产L－乳酸最佳。

图7 不同氮源对L－乳酸发酵的影响Fig.7 Effect of different nitrogen sources on L－lactic acid fermentation

确定酵母粉为最佳氮源后，对酵母粉添加量做进一步优化，装液量为100mL，结果如图8所示，当酵母粉添加量为1、2g时乳酸产量最高，从节约经济成本上考虑，选择添加量为1g较好，因此酵母粉添加量为1g。

图8 不同酵母粉添加量对L－乳酸发酵的影响Fig.8 Effect of different yeast extract concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.5 不同乙酸钠添加量对乳酸发酵的影响 装液量为100mL，接种量为10%，实验结果如图9所示。从图9中可以看出，当乙酸钠添加量为0.2g时，乳酸的产量最高，当乙酸钠添加量超过0.4g时菌体浓度逐渐降低，说明可能是高浓度的乙酸钠不利于菌体生长和L－乳酸的产生。

图9 不同乙酸钠添加量对L－乳酸发酵的影响Fig.9 Effect of different sodium acetate anhydrous concentration on L－lactic acid fermentation

2.2.6 磷酸二氢钾添加量对乳酸发酵的影响 装液量为100mL，实验结果如图10所示。当磷酸二氢钾添加量为0.1g时乳酸的产量最高，而菌体的浓度是随着磷酸二氢钾的添加量逐渐降低的，说明磷酸二氢钾的加入是不利于干酪乳杆菌菌体的生长，但是添加0.1g是有利于乳酸产量的增加，可能是菌体代谢过程中一定的磷酸盐有助于菌体进行代谢产乳酸。

图10 不同磷酸二氢钾添加量对L－乳酸发酵的影响Fig.10 Effect of different KH2PO4concentration on L－lactic acid fermentation

2.3 发酵培养基的响应面优化

2.3.1 响应面实验设计及结果 在单因素实验的基础上，选定葡萄糖、酵母粉和乙酸钠这三个对L－乳酸产量影响较大的变量进行进一步的优化，各因素的中心点水平的值根据单因素优化的最佳值来确定，采用B－B实验进行三因素三水平的响应面分析，实验包括12个析因实验和3个中心实验，应用Design－Expert8.0.7.1对葡萄糖、酵母粉和乙酸钠这三个因素进行优化。

表2 三因素三水平的B－B实验设计及结果Table 2 Designs and the results of Box－Behnken

二次回归方程为:Y=146.67+5.00A+18.12B+1.88C+11.25AB+1.25AC－7.50BC－5.83A2－27.08B2－7.08C2，此方程为编码值的方程，式中 A、B、C、分别为葡萄糖、酵母粉、乙酸钠。该回归方程的方差分析如表3，三个因素影响显著性的顺序为:酵母粉＞葡萄糖＞乙酸钠。其中模型p=0.0023＜0.05，失拟项p=0.1318＞0.05，说明该模型回归显著，而失拟不显著。另外该方程系数R2=0.9096，说明回归方程的拟合程度较好，预测值与实测值之间具有较高的相关性，可以应用于L－乳酸产量的理论预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA of quadratic polynomial model

在获得回归非线性模型后，为求得三个因素的最佳值，根据所得到的回归模拟方程分别对各变量求一阶偏导数，并令其为0，得到一个三元一次方程组［15］，解此方程组可得到模型的极值(此值为各因素实际值):A(葡萄糖)=17.85g/100mL，B(酵母粉)=1.27g/100mL，C(乙酸钠)=0.19g/100mL。即当葡萄糖、酵母粉、乙酸钠分别为 17.85、1.27、0.19g/100mL时，理论值L－乳酸产量为153.38g/L。

2.3.2 各因素之间的交互作用 葡萄糖、酵母粉、乙酸钠这三个因素之间的两个独立变量之间的交互作用见图11～图13，当研究两个独立变量之间交互作用时，此时的第3个变量的编码值为0，第3个变量取中心点值［15］。

图11 Y=f(A，B)的响应面图Fig.11 The response surface chart of Y=f(A，B)

图12 Y=f(A，C)的响应面图Fig.12 The response surface chart of Y=f(A，C)

图13 Y=f(B，C)的响应面图Fig.13 The response surface chart of Y=f(B，C)

2.3.3 验证实验分析 根据上述优化后，干酪乳杆菌的发酵培养基为(g/100mL):葡萄糖17.85，酵母粉1.27，乙酸钠 0.19，磷酸二氢钾 0.1，MgSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.005，吐温－80 1mL，一次性添加CaCO310g/100mL。液体种子培养基先静置培养12h再振荡培养到20h接种到发酵培养基中，发酵条件为:装液量 100mL，接种量 10%，温度 37℃，转速150r/min，培养时间96h，在此条件下进行实验，三个平行的摇瓶实验测得的 L－乳酸产量为:145、155、140g/L，平均值为146.67g/L，与理论预测值153.38g/L比较接近，是优化前乳酸产量的2.03倍。验证实验结果说明了实验设计和响应面分析法能够较好的模拟干酪乳杆菌发酵生产L－乳酸的发酵条件，结果可靠。通过单因素和响应面实验优化后，使得本实验室筛选得到的野生型干酪乳杆菌发酵生产L－乳酸的产量达到146.67g/L，在摇瓶水平上L－乳酸产量略微高于目前相关文献［5］报道的同类野生型干酪乳杆菌的最高L－乳酸产量143.8g/L，说明该菌株有较好的工业应用前景。

经过单因素和响应面优化后，干酪乳杆菌在优化后的最优条件下进行发酵96h后，乳酸的色谱图如图14所示，从图中可以看出L－乳酸出峰时间为17.953min，D－乳酸的出峰时间为 23.738min，L－乳酸的色谱峰面积为11244.4，D－乳酸的色谱峰面积为443.379，经计算得L－乳酸的光学纯度为96.21%，比优化前的光学纯度提高了6.09%，同时优化后的L－乳酸光学纯度接近于相关文献［10］报道的同类野生型干酪乳酸菌的高光学纯度96.6%。

图14 乳酸的光学纯度分析色谱图Fig.14 Chiral analysis of lactic acid

3 结论

采用单因素实验和Box－Behnken中心组合原理以及响应面分析法对干酪乳杆菌ZW－63A发酵条件进行了优化，使L－乳酸产量有了较大幅度的提高，葡萄糖、酵母粉和乙酸钠这三个因素对L－乳酸产量拟合出的回归模型经检验证明该模型合理可靠，能较好的预测L－乳酸的产量，通过模型系数显著性检验，得到的因素主效应关系为:酵母粉＞葡萄糖＞乙酸钠，由该模型确定的最佳条件为葡萄糖17.85g，酵母粉1.27g，乙酸钠0.19g，在此条件下，得到的L－乳酸产量为146.67g/L，是优化前的2.03倍。本实验的重要性和突破性在于，发现了种子培养方式、中和剂添加方式和培养基组成能够影响L－乳酸的产量和光学纯度，对实验室筛选得到的野生型干酪乳杆菌，通过单因素和响应面实验优化后，在摇瓶水平上，L－乳酸的产量略微高于目前相关文献［5］报道的同类野生型干酪乳杆菌的最高L－乳酸产量143.8g/L，同时优化后的L－乳酸光学纯度提高到96.21%，接近于相关文献［10］报道的同类野生型干酪乳酸菌的L－乳酸高光学纯度96.6%，说明该菌株有较好的工业应用前景。

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