基质衍生因子-1对脐带血CD34+细胞增殖及归巢相关功能影响的研究▲

段相会 李桥川

(广西医科大学第一附属医院血液内科，南宁市 530021)

基质衍生因子-1(SDF-1)是趋化因子CXC亚家族成员，研究显示SDF-1在造血干/祖细胞(HSPC)的迁移、增殖及分化过程中发挥重要的作用，但其作用尚未完全清楚［1］。鉴于此，我们通过研究 SDF-1对 UCB CD34+细胞增殖及迁移功能的影响，了解 SDF-1对HSPC的作用，并探讨SDF-1应用于UCB HSPC体外培养的可能性。

1 材料和方法

1．1 标本来源和细胞制备 无菌采集健康足月产新生儿脐血，应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC)。应用MACS CD34+细胞单选试剂盒(Miltenyi Biotch Inc．Sunnyvale，CA)，按试剂盒说明分离纯化CD34+细胞。

1．2 检测SDF-1对CD34+细胞体外凋亡的影响 将分选的CD34+细胞加入到 IMDM(GIBCO Inc．，USA)培养基中，调细胞密度为1×105/mL，接种24孔板，每孔加入1 mL，分6组，每组复设3孔。1组为对照组，不加SDF-1;其余5组为实验组，加入不同浓度的 SDF-1(1、50、100、500、1 000 ng/mL)。于 37℃、体积分数为5%的CO2的饱和湿度的孵箱中培养。第4天计数细胞数、存活细胞数与加入细胞数的比值为生存率。按试剂盒说明使用AnnexinV:FITC Apoptosis Detction Kit I(BD Pharmmgen，USA)，用流式细胞仪(Becton Dickinson FACSVantage)测定细胞凋亡率。SDF-1为Peprotech EC公司产品。

1．3 检测SDF-1对UCB CD34+细胞体外集落培养的影响 培养基为甲基纤维素培养基MethoCultTMGF+H4435(Stem Cell Tech Inc．，Canada)，内含细胞因子 SCF 50 ng/mL，IL-3、IL-6、GM-CSF 和 G-CSF 各为 20 ng/mL以及Epo 3 U/mL。接种纯化的CD34+细胞500 ng/mL，每份标本接种24孔板3孔，每孔0．5 mL。1组为对照组:不加SDF-1;其余5组为实验组:加入不同浓度的SDF-1(1 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL)。于37℃、体积分数为5%的CO2的饱和湿度的孵箱中培养28 d，在第14天计数50个细胞以上的粒/单－集落形成单位(CFU-GM)、红系爆式－集落形成单位(BFU-E)和混合－集落形成单位(CFU-MIX)，在第28天计数高增殖潜能－集落形成单位(HPP-CFU)，标准为直径＞0．5 mm、细胞数＞50 000的高密度粒/单细胞型集落。

1．4 SDF-1对UCB CD34+细胞黏附能力的影响 检测新分选的脐血CD34+细胞(对照组)、在37℃下与SDF-1(50 ng/mL)孵育 2 h的新鲜脐血 CD34+细胞(SDF-1组)。用含20μg/mL人纤连蛋白(FN)的PBS包被96孔板，50μl/孔，4℃过夜。用PBS洗3次，再用100μl/阻断缓冲液(含20 g/L BSA的IMDM)37℃阻断2 h，PBS洗3次。将CD34+细胞悬浮于黏附缓冲液(含5 g/L BSA的IMDM)，调细胞密度为1×105/mL，加入孔板，100μl/孔。每份标本分3组:A组为不加细胞只加100μL黏附缓冲液的空白组;B组为CD34+细胞组;C组为CD34+细胞阳性对照组。每组复设3个孔。37℃孵育1 h，吸去B组缓冲液和非黏附细胞。用MTT比色法检测细胞与FN间的黏附效率。具体操作如下:用黏附缓冲液轻轻洗涤B组细胞三次，尽量去除所有非黏附细胞后加入100μL黏附缓冲液。100μL细胞悬液中加入MTT 20μL(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，离心弃上清，加二甲基亚砜 100μl/孔，振荡混匀，用酶标仪(SLT SPECTRAⅡ型)在570 nm处测吸光度(A570)。黏附率(%)×100%

1．5 SDF-1对UCB CD34+细胞迁移能力的影响 我们设新分选的脐血CD34+细胞为对照组，新分选的脐血CD34+细胞在37℃下与SDF-1(50 ng/mL)孵育2 h为SDF-1组。趋化试验采用 5μm的 transwell板(24-well cell，cluster;Costar，Corning Inc．，USA)，实验前用趋化缓冲液(含5 g/L BSA的IMDM)漂洗滤膜1次，吸去上清。将CD34+细胞悬浮于趋化缓冲液中，调细胞浓度为1×106/mL，transwell板的上层添加细胞悬液100μL，下层添加趋化缓冲液600μL，每个实验组复设两孔。在37℃、体积分数为5．0%的CO2条件下孵育4 h，用流式细胞仪测定细胞的迁移率。具体方法如下:将transwell板下层的细胞收入管中，另取原细胞悬液100μL加缓冲液500μL，振荡混匀，分别用流式细胞仪高速计细胞数20 s。每孔计数3次，取平均值。我们设对照组的迁移率为100%，SDF-1组的迁移率与对照组相比较为相对迁移率。

1．6 统计学处理 数据用SPSS 10．0统计软件分析，数据描述为±s，数据采用方差分析，P ＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 SDF-1对UCB CD34+细胞凋亡及生存的影响 加入SDF-1的实验组的早期凋亡细胞比例显著低于对照组(P＜0．05，n=4)，加入SDF-1的实验组的生存率显著高于对照组，剂量与效应相关，加入SDF-1 50 ng/mL即与对照组存在显著性差异，加入SDF-1 100 ng/mL即达到最大效应，进一步增加剂量并不能进一步增加抑制凋亡效应。提示SDF-1能够通过抑制UCB CD34+细胞凋亡增强其体外生存能力。结果见表1。

表1 SDF-1对CD34+细胞凋亡及生存的影响 (%±s)

表1 SDF-1对CD34+细胞凋亡及生存的影响 (%±s)

注:与对照组比较，*P ＜0．05。

组别 凋亡率 生存率对照组18．99 ±2．23 53．75 ±4．84 1 ng/mL 18．32 ±1．82 51．30 ±3．42 50 ng/mL 12．22 ±1．15* 76．25 ±2．17*100 ng/mL 9．26 ±1．22* 79．38 ±3．13*500 ng/mL 13．20 ±1．73* 70．00 ±2．70*1 000 ng/mL 13．25 ±2．27* 73．38 ±4．84*

2．2 SDF-1对UCB CD34+增殖的影响 加入SDF-1可提高CFU-GM产率，加入SDF-1 50 ng/mL即与对照组存在显著性差异(P＜0．05)。加入SDF-1导致BFU-E产率减低，呈剂量依赖，加入SDF-1达到或超过100 ng/mL时与对照组存在显著性差异(P＜0．05)。各组间的CFU-MIX、HPP-CFU产率无显著性差异(P＞0．05)。结果见表2。

表2 SDF-1对CD34+细胞增殖的影响 (集落数/2500个CD34+细胞±s)

表2 SDF-1对CD34+细胞增殖的影响 (集落数/2500个CD34+细胞±s)

注:与对照组组比较，*P ＜0．05。

Group BFU-E CFU-GM CFU-MIX HPP-CFC对照组 204．00 ±13．77 371．50 ±61．96 41．25 ±4．32 38．75±4．09 1 ng/mL 201．50 ±14．47 390．00 ±65．74 42．25 ±4．97 39．25 ±4．75 50 ng/mL 186．25 ±10．62 493．50 ± 58．61* 39．00 ±5．73 38．75 ±3．93 100 ng/mL 176．75 ±10．24* 531．00 ±79．2* 43．25 ±5．64 42．25 ±4．44 500 ng/mL 167．25 ±10．92* 514．50 ±75．63* 39．25 ±6．63 39．25 ±4．15 1 000 ng/mL 149．50 ±7．64* 454．40 ±56．29*38．25 ±4．87 39．75 ±3．40

2．3 SDF-1对UCB CD34+归巢相关功能的影响 经SDF-1(50 ng/mL)作用后的新鲜脐血CD34+细胞的黏附率为(68．05±4．95)%，显著高于对照组的(55．83±4．20)%(P ＜ 0．05，n=3)。 经 SDF-1(50 ng/mL)作用后的新鲜脐血CD34+细胞的相对迁移率为(148．04±3．21)%，显著高于对照组的 100．00%(P ＜0．05，n=3)。

3 讨论

脐带血造血干细胞移植(CBT)已经成功应用于治疗各种血液病，但单份UCB里的HSPC数量不足及UCB HSPC的归巢功能缺陷等影响CBT移植疗效。通过体外培养扩增UCB HSPC的数量及增强其归巢能力是解决该问题的方法之一，仍需要进一步研究优化体外培养细胞因子组合方案［1］。我们将 SDF-1加入到 UCB CD34+细胞培养体系中，研究SDF-1能否有利于UCB HSPC生存及增殖，能否增强UCB CD34+细胞归巢相关功能。

Lataillade 等［3，4］研究认为，SDF-1 能抑制 CD34+细胞凋亡，SDF-1能抑制Bad和Bax蛋白表达，上调Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达，该效应与SDF-1能够激活CD34+的PI-3K-AKT和MAPK途径相关。本研究证明SDF-1能够通过抑制UCB CD34+细胞凋亡而增强其体外生存能力，呈剂量依赖性，UCB CD34+细胞培养体系中SDF-1浓度达到或超过50 ng/mL可产生显著的抑制凋亡效应，使UCB CD34+细胞生存率提高。

目前SDF-1对HSPC增殖功能的影响还存在争议。Lataillade 等［3，4］研究认为，SDF-1(0．01 ～ 0．5 ng/mL)能够诱导人周血CD34+细胞由G0期进入G1期，与SCF等生长因子协同可以进一步扩增人周血CD34+Lin－细胞数量及促进造血祖细胞集落形成。然而Gibellini等［5］报道，SDF-1在200 ng/mL的浓度条件下选择性抑制红系分化，其机制可能是与 SDF-1上调 Fas/CD95 ligand表达有关。Vichalkovskia等［6］研究认为，SDF-1 选择性抑制红系分化，其机制可能是SDF-1刺激后在红系定向祖细胞会形成与蛋白激酶C(PKC)β和c-Abl相关的发育调节负反馈，而在多潜能祖细胞该负反馈不会被激活，SDF-1并不抑制HSPC的增殖。上述研究提示，争议存在的原因在于不同的研究使用的细胞类型不同、SDF-1浓度差异和有无其他造血因子协同的影响。本研究结果显示，在甲基纤维素培养基 H4435中加入SDF-1可增加CFU-GM的产率，SDF-1对粒系增殖影响呈浓度依赖性，SDF-1达到或超过50 ng/mL时CFU-GM的产率显著高于对照组。同时，SDF-1与其他造血因子协同(SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF 和 Epo)可在一定程度上促进粒系祖细胞增殖。此外，SDF-1抑制红系祖细胞增殖的影响呈浓度依赖，SDF-1达到或超过100 ng/mL时BFU-E的产率显著低于对照组，但低浓度SDF-1对红系祖细胞增殖的抑制并不显著。而且我们前期研究也提示SDF-1并不抑制HSPC的增殖［7］。

本研究显示经SDF-1(50ng/mL)作用后的新鲜脐血CD34+细胞的黏附率、迁移率显著高于未经SDF-1作用的新鲜脐血 CD34+细胞。结果提示，SDF-1与 UCB CD34+细胞共培养能够增强其归巢相关功能，有利于纠正UCB CD34+细胞的归巢功能缺陷问题。

总之，SDF-1能够通过抑制UCB CD34+细胞凋亡增强其生存能力，与其他造血生长因子协同能够促进粒系增殖，能够提高UCB CD34+细胞归巢相关功能，因此SDF-1能应用于UCB CD34+细胞体外培养。

［1］ Sharma M，Afrin F，Satija N，et al．Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling:indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow ［J］．Stem Cells Dev，2011，20(6):933 －946．

［2］ Broxmeyer HE．Enhancing engraftment of cord blood cells via insight into the biology of stem/progenitor cell function［J］．Ann N Y Acad Sci，2012，1266:151 －160．

［3］ Lataillade JJ，Clay D，Dupuy C，et al．Chemokine SDF-1 enhances circulating CD34(+)cell proliferation in synergy with cytokines:possible role in progenitor survival［J］．Blood，2000，95(3):756 －768．

［4］ Lataillade JJ，Clay D，Bourin P，et al．Stromal cell-derived factor 1 regulates primitive hematopoiesis by suppressing apoptosis and by promoting G(0)/G(1)transition in CD34(+)cells:evidence for an autocrine/paracrine mechanism［J］．Blood，2002，99(4):1117 －1129．

［5］ Gibellini D，Bassini A，Re MC，et al．Stroma-derived factor 1alpha induces a selective inhibition of human erythroid development via the functional upregulation of Fas/CD95 ligand［J］．Br JHaematol，2000，111(2):432 －440．

［6］ Vichalkovski A，Baltensperger K，Thomann D，et al．Two different pathways link G-protein-coupled receptors with tyrosine kinases for the modulation of growth and survival in human hematopoietic progenitor cells［J］．Cell Signal，2005，17(4):447 －459．

［7］ 李桥川，李云涛，邱录贵，等．基质衍生因子-1和血小板第4因子对体外扩增后脐血CD34+细胞黏附特性和趋化功能的影响［J］．中国实验血液学杂志，2006，14(1):83－88．