宫颈癌组织中突变型p53基因的表达及其临床意义

楼朝霞，梅丽娜

（湖州市妇幼保健医院妇产科，浙江 湖州 313000）

抑癌基因是一类细胞生长的负调控基因，因基因缺失、突变、重组等导致其正常功能失活，是细胞恶性转化的重要启动因素，而p53基因是迄今发现与恶性肿瘤相关性最高的抑癌基因之一。野生型p53基因的蛋白产物能维持基因组稳定，具有抑制或阻止细胞转化的功能，从而抑制肿瘤的发生，它的失活对肿瘤形成起重要作用[1-2]。而突变型p53基因不仅失去了对细胞的监视功能且本身还有促进恶化的活性，使细胞无限制的生长，是一种癌基因[3]。在宫颈癌中，野生型p53基因失活，而突变型p53基因产生突变型p53蛋白不能正常调节细胞生命活动。本研究采用PCR技术检测宫颈癌中突变型p53基因的表达，以探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 材料来源 57例宫颈癌组织均取自2000年9月至2006年6月在本院行全子宫切除术标本并经病理组织证实为宫颈癌患者，其中鳞癌56例，占98.12%，腺癌1例，占1.18%；病理Ⅰ级8例(14.10%)、Ⅱ级22例(38.16%)、Ⅲ级27例(47.14%)。其临床大体病理分型为：菜花型31例(60.18%)、结节型17例(33.13%)、溃疡型3例(5.19%)。按FIGO临床分期：Ⅱ期9例，占17.16%；Ⅲ期42例，占82.14%(因6例标本缺乏临床资料，不包括在临床大体病理分型及临床分期中)。宫颈癌患者取宫颈组织标本前均未接受过放疗和化疗。正常对照15例、慢性宫颈炎15例，来源于因子宫肌瘤行全子宫切除的标本。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 记录患者的姓名、年龄、病程、是否经过治疗等资料。

1.2.2 基因组DNA制备 采用改良TES水浴法提取标本组织的DNA，置于-80℃保存备用。具体方法参照参考文献[5]。

1.2.3 聚合酶链反应 (1)设计引物：根据Buchman等[5]的p53基因顺序设计引物，选外显子5、6、7、8作为研究对象，引物由上海夏华生物公司合成。(2)PCR操作：采用本室配制的体系。按94℃30 s、63℃ 45 s、72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，参数循环32个周期。PCR扩增产物4℃保存。

1.2.4 PCR产物检测 配制2%的琼脂糖凝胶(含1.5 μg/ml溴化乙锭)，取5 μl产物与1 μl溴酚兰上样液混匀后加样，于1×TAE缓冲液中，70 V电泳约40 min，在紫外光下观察扩增条带。

1.3 统计学方法 录入数据，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)资料表示，采用t检验。计数资料应用χ2检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者基因组DNA的含量及纯度 宫颈癌患者基因组DNA的含量1～2 μg/g，其吸光度A260/A280值(即纯度值)为(1.81±0.17)。

2.2 宫颈癌患者基因组DNA PCR扩增的电泳图 由图1可见，2、3、5、6泳道为p53突变型，1、4泳道为p53野生型，M为AL5000DN Marker。

图1 p53基因PCR扩增电泳图

2.3 实验结果 突变型p53基因在宫颈正常上皮、慢性宫颈炎和宫颈癌组织中的表达率分别为：0%、40.00%和71.93%。其中宫颈癌与正常宫颈组织间阳性表达率比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，突变型p53基因在宫颈癌中的阳性表达率明显高于慢性宫颈炎(P＜0.05)，慢性宫颈炎与正常宫颈组织间的阳性表达率差异亦有统计学意义(P＜0.05)。突变型p53基因在低分化患者宫颈癌组织中的阳性表达率明显高于中高分化组(P＜0.05)。突变型p53基因阳性的宫颈癌患者的5年生存率明显低于阴性的患者，见表1。突变型p53基因的表达阳性率在肿瘤的直径、淋巴结转移情况差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表1 突变型p53基因阳性与术后生存率的关系

表2 突变型p53基因阳性率与宫颈癌标本的临床和病理指标的关系

3 讨论

宫颈癌是女性生殖器最常见的恶性肿瘤之一。每年新增病例约50余万，多发生在25～40岁，有年轻化的趋势，而宫颈炎到癌前病变到宫颈癌有一个较长的过程，因此宫颈癌是一种可以早期预防、诊断和治愈的疾病[6]。而p53基因是与癌症的发展密切相关，研究表明，50%以上的恶性肿瘤患者会有p53基因突变或缺失[7]。

人类p53基因位于染色体17q13，基因全长16～20 kb，编码393个氨基酸的磷蛋白，包含11个外显子和10个内含子。p53基因有野生型和突变型两种。野生型p53基因存在于正常细胞中，是一种抑癌基因，主要具有生长捕获和诱导细胞凋亡的功能。突变型p53基因则失去上述功能[8]，促进细胞恶性转化，是一种癌基因。在宫颈癌中，野生型p53基因失活，而突变型p53基因产生突变型p53蛋白不能正常调节细胞生命活动。其次，与野生型p53基因功能相关的基因网络不能正常发挥功能。另外，野生型p53基因与突变型p53基因在肿瘤细胞中相结合，使野生型p53基因丧失抑癌功能也是一个重要的因素[1-3]。研究表明p53基因结构及表达异常与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关，已发现的有肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等等[8-9]。从本研究资料表明，宫颈癌组织标本中突变型p53基因的阳性表达率明显高于正常宫颈组织及慢性宫颈炎组织。在宫颈癌组织标本中，突变型阳性表达率临床晚期高于临床早期，淋巴结转移高于淋巴结未转移并且突变型p53基因阳性的宫颈癌患者的5年生存率明显低于阴性的患者，揭示出突变型p53基因表达情况与宫颈癌恶性程度、临床进展及预后密切相关。

本研究采用PCR技术，用最简单、有效、直观的方式从不同病理分级的宫颈癌患者中发现p53的突变类型和转录活性，探讨突变型p53基因的表达与宫颈癌恶性程度、临床进展及预后的相关性，对于国内宫颈癌和p53基因的研究和临床上推广使用具有重大意义。

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