超高压处理对海参体壁粗酶活性的影响

郝梦甄，胡志和，肖学勇

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

海参（Stichopus Japonicus）又名刺参、沙哩等，棘皮动物门，海参纲，是重要的海洋无脊椎动物，已有5000万年历史，种类有1200多种。我国海参主要分布在黄海、渤海海域和广东、广西及海南沿海，主要经济品种分别为刺参和梅花参，其中刺参是我国品质最好的海参种类之一[1]。研究证明，海参体壁中含有海参多糖、海参皂苷、海参胶原蛋白、海参脑苷酯、神经节苷酯等多种生物活性物质[2]，具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗衰老等多种生理功效[3－5]。目前海参的传统加工方法主要是将鲜海参制作成干参或盐渍参[6]，大量的活性成分在加工过程中流失，但鲜海参因其自溶酶的作用很难在常温下保存，组织蛋白酶B（Cathepsin B，CB）是一种溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶，对肌肉蛋白质有广泛的降解作用[7]。因此鲜海参保藏问题亟需解决。超高压技术（ultra high－pressure，UHP）是一种新型的非热杀菌技术，起源于化工领域，能有效杀灭食品中的微生物[8－10]，保留有效功能成分和芳香物质，并且在一定压力范围能有效抑制食品中的酶类[11－13]。由于酶的化学本质是蛋白质，其生物活性与其三维结构有关，酶的生物活性产生于活性中心，活性中心是由分子的三维结构产生的[14]。蛋白质的二级和三级结构的改变与体积变化有关，而超高压有利于体积减小的反应发生，因此酶活会受到高压的影响。每种酶都存在最低失活压力，低于这个压力酶就不会失活，在特定时间内当压力超过这个值时酶失活速度会加速直到完全失活[15]。Ludikhuyze等[16-17]对超高压下的动力学研究得出，各类酶的超高压灭活酶模型主要符合一级反应动力学模型（A=A0e-kt）。恒温恒压条件下K的获得都采用Eyring理论和Arrhenius理论[18]。目前超高压的应用主要用于果蔬汁的冷杀菌以及肉类、水产的杀菌及保藏中，为了探索超高压技术在鲜海参加工中的应用，本实验研究了超高压技术对从海参体壁中提取的粗酶酶活的影响，为鲜海参的超高压加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜海参 购于烟台鲍参堂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵（均为分析纯） 天津市凯通化学试剂有限公司；干酪素（化学纯）天津市东方卫生材料厂；氢氧化钠、碳酸钠（分析纯）天津市北方天医化学试剂厂；三氯乙酸（分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；酪氨酸 美国Sigma公司；Folin-Phenol 喜润（上海）生化试剂有限公司。

HPP.L3-600/0.6超高压生物处理机 天津市华泰森森生物工程技术有限公司；FA1104N电子天平上海精密科学仪器公司；JJ-2（2003-61）组织捣碎匀浆机 常州国华电器有限公司；sigma 3-18k离心机北京博劢行仪器有限公司；电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；VELP旋涡振荡器 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Scientz-50N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 海参体壁粗酶的提取 参考朱蓓薇[19]的研究方法稍作改进，新鲜海参去内脏后用去离子水冲洗干净，经组织捣碎匀浆机捣碎的海参肉25g加入0.1mol/L pH6.3的磷酸缓冲液（PBS）75mL浸提，即质量体积比1∶3。4℃下静置过夜后8000r/min离心10min，收集上清液，加入（NH4）2SO4至20%饱和度，4℃静置4h，8000r/min离心10min。弃沉淀，上清液继续加入至70%饱和度，4℃静置4h，8000r/min离心10min。沉淀经冷冻干燥后，4℃保存。

1.2.2 超高压处理 取1g干酶粉末加入0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH=6.3）6mL溶解，取粗酶液装于真空密封袋中，真空密封后进行超高压处理，每组样品做三次平行。单因素处理条件为：室温（15℃）在压力分别为0、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa下处理10min；室温下300MPa分别处理0、10、15、20、25、30、35、40min；分别在温度15、20、30、40、45、50℃下300MPa处理10min。

在单因素实验的基础上，设计正交实验，因素及水平见表1。

表1 超高压抑制海参体壁粗酶的正交实验因素及水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test of the inhibiting enzyme from Stichopus Japonicus body wall with UHP

通过正交实验获得超高压抑制海参体壁粗酶酶活的最优处理条件后，在此条件下对鲜海参进行超高压处理，并按照方法1.2.3进行粗酶提取后进行酶活测定。

1.2.3 酶活测定 按照SB/T10317-1999蛋白酶活力测定方法进行测定，紫外可见分光光度计测定波长为660nm。粗酶活力按式（1）计算。

式中：C为根据样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4为4mL反应液取出1mL测定（即4倍）；N为酶液稀释的倍数（6倍）；10为反应10min；W为样品水分百分含量（0%）。

根据标准配制酪氨酸标准溶液后在660nm下进行吸光值测定，以未处理样品的酶活力为100%，处理后样品的酶活力与未处理样品酶活力的比值为酶活残存率，按式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

标准曲线测定结果如图1所示。

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 The standard curve of tyrosine solution

由图1可知，酪氨酸浓度增大，光密度增加，并呈线性关系，通过线性回归分析可得回归方程：y=0.0132x+0.0227，R2=0.9978。

2.2 超高压处理对海参体壁粗酶活性的影响

2.2.1 超高压处理压力对海参体壁粗酶活性的影响

压力大小对海参体壁粗酶活性的影响结果如图2所示。

图2 15℃下不同压力处理10min对海参体壁粗酶活性的影响Fig.2 Effect of different pressure treatment on the enzyme activity of Stichopus Japonicus body wall for 10min at 15℃

由图2可以看出，在较低压力范围内，随着压力的升高，海参体壁粗酶的酶活逐渐升高，250MPa处理时，酶活残存率最高为100.78%，未处理的鲜海参体壁粗酶酶活为100.6U，250MPa下处理后酶活为101.38U，这与夏远景[20]的实验结果有差异，可能与实验材料本身特性有关。250MPa时的酶活残存率大于100%，说明超高压改变了海参体壁粗酶的原有结构，使其更易与底物酪蛋白反应。随着压力逐渐升高，海参体壁粗酶的酶活逐渐降低，酶活受到明显抑制，600MPa时，酶活为24.37U，酶活残存率最低为24.22%，说明超高压处理能够有效抑制海参体壁粗酶的酶活力。

2.2.2 超高压处理时间对海参体壁粗酶活性的影响

处理时间对海参体壁粗酶活性的影响的结果如图3所示。

图3 15℃下300MPa处理不同时间对海参体壁粗酶活性的影响Fig.3 Effect of different pressure treating time with 300 MPa at 15℃on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

从图3可以看出，常温下随着超高压处理时间的延长，海参粗酶酶活先降后升再降，在处理15min时，酶活残存率存在最大值，为77.02%；15min后随着时间的延长，酶活逐渐受到抑制而降低，超高压处理40min时，酶活残存率最低，为36.76%。本实验说明随着处理时间的延长，海参体壁粗酶酶活将会受到有效抑制。

2.2.3 超高压处理温度对海参体壁粗酶活性的影响

处理温度对海参体壁粗酶活性的影响的结果如图4所示。

图4 不同温度下300MPa处理10min对海参体壁粗酶活性的影响Fig.4 Effect of different temperature with 300MPa for 10min on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

由图4可以明显看出，超高压处理在一定温度范围内，海参体壁粗酶酶活残存率有升高的趋势，在海参体壁粗酶反应最适温度40℃时，酶活残存率最高为83.45%；温度高于40℃后，随着温度的升高，海参体壁粗酶酶活明显降低，50℃时最低为52.42%；说明在温度高于40℃时，升高超高压处理的温度能够有效抑制海参体壁粗酶酶活力。

2.2.4 超高压处理对海参体壁粗酶活性的正交分析结果 由表3对超高压处理海参体壁粗酶的正交实验方差分析可以看出，超高压处理的压力、时间和温度三因素均对粗酶残存率影响显著，结合正交实验的极差分析可以得出，在实验设定的条件范围内，使酶活残存率最低的条件即超高压处理的最优条件压力为600MPa、时间为35min、温度为45℃。经实验验证在该条件下处理的海参体壁粗酶酶活残存率为19.11%，结果优于表2中的数值。

表2 L9（34）正交实验结果Table 2 Experimental design and results for L9（34）orthogonal test

表3 正交实验结果方差分析表Table 3 Variance analysis for orthogonal array experimental results

2.2.5 超高压处理对鲜海参中粗酶的影响 在45℃下，600MPa处理35min条件下，利用超高压直接处理鲜海参后进行体壁粗酶提取并测定酶活，酶活残存率为28.43%，结果比验证实验中超高压直接作用于粗酶液的残存率值19.11%高，说明海参体壁组织对其中的粗酶有保护作用。

3 讨论与结论

目前，对海参体壁中粗酶组成成分的研究不是很深入，杜英等[21]从海参肠及海参体壁中提取了海参乙酰胆碱酯酶粗酶并对其酶学性质进行了研究，发现其最适反应pH为8.0，最适反应温度为35℃左右，与海参自溶的一种重要的酶是海参体壁组织蛋白酶B。Turk等[22]研究发现组织蛋白酶B是能直接或间接地激活细胞凋亡的主要蛋白酶，与细胞凋亡关系密切。赵露露等[23]已从海参体壁中提取了海参体壁组织蛋白酶B，并对其酶学性质进行了研究，发现其最适反应pH为5.5，最适反应温度为40℃。以上两种酶的最适反应pH及最适反应温度与本实验的粗酶系有所差距，说明酶单独作用与综合作用条件不一致。

本实验通过研究可知，在较高的处理条件下超高压对海参体壁粗酶酶活抑制效果明显，并通过正交实验获得超高压处理抑制海参体壁粗酶酶活的最优条件为压力600MPa，时间35min，温度45℃，实验验证海参体壁粗酶酶活残存率结果为19.11%，并且在此条件下测得超高压直接作用鲜海参的体壁粗酶酶活残存率也仅为28.43%，充分说明了超高压处理能够有效抑制酶活力，这为超高压处理在海产品中广泛应用提供了一定理论依据。

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