嗜酸乳杆菌微胶囊制剂工艺初步研究

谢跃武，苏振成，王 硕，孙 健，马福海，毛大庆，*，张惠文

(1.沈阳药科大学，辽宁沈阳110016;2.森林与土壤生态国家重点实验室，中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110064)

微生态制剂是根据微生态学原理，通过调整微生态失调，保持微生态平衡，提高宿主的健康水平，利用对宿主有益的微生物或促进物质所制成的制剂。与抗生素相比，微生态制剂具有广谱、非特异性抗菌杀菌作用［1］。目前，国内市场上有多种微生态制剂。其中，芽孢杆菌因能形成抗逆性强的芽孢而得到广泛应用;乳酸菌益生效果良好，但不形成芽孢故抗逆性差、易失活而不适合生产应用。为了提高菌体的耐受性，延长微生态制剂货架期，在菌剂制备过程中需进行膜包被或制成微胶囊［2］。然而，与国外微胶囊制备技术相比，国内相关技术仍不够成熟。挤压法是微胶囊技术中最常用的包被方法，其基本原理是将益生菌与亲水性胶体混合，通过针或喷嘴挤出，逐滴滴入硬化液中，形成大小均匀的胶粒［3］。海藻酸钠存在于褐藻中，是挤压法常用的载体，它完全无毒，具有良好的生物相容性和成膜性。当海藻酸钠遇到钙离子时，钠离子即被置换出来，生成不溶于水的海藻酸钙凝胶，此凝胶在pH＜6.0时不易溶解，在pH＞8.0时易溶解，符合动物肠溶性微胶囊制备的要求［4］。嗜酸乳杆菌具有缓解乳糖不耐症、调整肠道菌群平衡、抑制肠道不良微生物的增殖、改善便秘、降低胆固醇和血氨、抗癌等作用［5］，本研究以嗜酸乳杆菌为实验菌株，海藻酸钠为载体，探索以挤压法制备嗜酸乳杆菌微胶囊的最佳工艺，为工业化生产微生态制剂提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中国普通微生物菌种保藏管理中心(菌种编号:1.2467);海藻酸钠、氯化钙、脱脂奶粉、谷氨酸钠、胃蛋白酶、胰蛋白酶、钙黄绿素、酚酞、氢氧化钾、EDTA;MRS液体培养基 胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖 20.0g，柠檬酸三铵 2.0g，MgSO4·2H2O 0.58g，K2HPO42.0g，乙酸钠 5.0g，吐温 80 1.0mL，MnSO4·4H2O 0.25g，蒸馏水 1.0L，pH6.2～6.4;破囊液0.2mol/L pH7.0PBS(5.01g Na2HPO4溶于70mL水取61mL，1.25g NaH2PO4溶于 40mL 取 39mL，混合121℃灭菌20min);人工胃液(pH1.2)取0.1mol/L HCl 16.4mL，加水约800mL，胃蛋白酶(活性3.000～3.500NFU/mg)10g，搅匀后加水定容至1000mL;人工肠液 9mL HCl加入1000mL水中，取出750mL再加入0.2mol/L的KH2PO4溶液250mL和胰酶(活性＞250u/mg)10g，调节 pH至6.8;所用试剂均为分析纯。

ZDX－35SBI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;BCN－1360型生物洁净工作台 中国科学院武汉科学仪器厂;恒温摇床 中科院武汉科学仪器厂;THZ－82B型气浴恒温振荡器 江苏省金坛市医疗器械厂;DPX－9052B－1型电热恒温培养箱 中国科学院武汉科学仪器厂;Nanodrop® 分光光度计 美国NanoDrop公司;高速离心机5415C 德国Eppendorf公司;Modulyod－230型真空冷冻干燥机 美国Thermo Savant公司;微胶囊发生器 实验室自制，已申请专利。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化增殖 无菌开启冻干保藏菌种，接入装有MRS液体培养基的试管，37℃培养36h，活化3次。种子菌悬液以2%(V/V)接种量接入装有MRS液体培养基的三角瓶中，37℃培养36h，菌液浓度为8.9×109cfu/g。

1.2.2 嗜酸乳杆菌微胶囊的制备 取一定量的菌液→离心(5000r/min，8min，4℃)→得湿菌体，加入脱脂奶粉、谷氨酸钠混合液(乳化20min)→与海藻酸钠溶液(无菌)混合，搅拌均匀→利用自制微胶囊发生装置滴入氯化钙溶液中，并以磁力搅拌器搅拌，400r/min→静止固化(1h)→离心收集(350r/min，10min)→生理盐水洗涤3次→冷冻干燥(－50℃，0.02Mpa，24h)→得嗜酸乳杆菌微胶囊［6］。

1.2.3 嗜酸乳杆菌存活率的测定 存活率(%)=冻干后微胶囊中的活菌数/包被前的总活菌数×100

冻干后微胶囊中的活菌数:取1g微胶囊溶于50mL 0.2mol/L PBS(pH7.0)中，振荡0.5h后以稀释平板计数法计数，将测得的活菌数乘以稀释倍数再乘以溶液体积和冻干后微胶囊的质量即得冻干后微胶囊中的活菌数。包被前的总活菌数:确定海藻酸钠、乳化剂、菌体的混合液体积，在滴入氯化钙溶液之前取1mL以稀释平板计数法计数，将测得的活菌数乘以稀释倍数再乘以混合液体积即得包被前的总活菌数。

1.2.4 嗜酸乳杆菌微胶囊制备的单因素实验 通过单因素实验测定不同海藻酸钠浓度(1%、2%、3%、4%)、氯化钙浓度(1%、2%、3%、4%)、脱脂奶粉浓度(3%、4%、5%、6%)、谷氨酸钠浓度(0.5%、1%、1.5%、2%)对嗜酸乳杆菌微胶囊存活率的影响。

1.2.5 嗜酸乳杆菌微胶囊制备的正交实验 在单因素实验基础上，以海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、脱脂奶粉浓度、谷氨酸钠浓度为研究对象，采用L9(34)正交实验，以嗜酸乳杆菌的存活率为评价指标，选择最佳配比。因素水平表见表1。

1.2.6 钙离子浓度测定 配制海藻酸钠、谷氨酸钠、脱脂奶粉、菌泥混合液50mL滴入25mL 2%氯化钙溶液中，每滴入10mL测一次钙离子浓度。取1mL稀释40倍，使其浓度接近500mg/L(该方法在水中钙离子含量为500mg/L时，平行测定两结果差不大于2mg/L)，经过滤，移入250mL锥形瓶中，加16.8%盐酸3滴，混匀，加热煮沸30s，冷却至50℃以下，加5mL 20%氢氧化钾溶液，再加80mg钙黄绿素酚酞混合指示剂，用0.01mol/L EDTA标准溶液滴定至荧光黄绿色消失，出现红色即为终点。水样中钙离子含量X(mg/L)，平行测量3次取平均值，按下式计算:

式中:V－滴定时EDTA标准溶液消耗体积，mL;M－EDTA标准溶液浓度，mol/L;VW－水样体积，mL;110.98－氯化钙摩尔质量，g/mol。

表1 正交实验的因素和水平Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

1.2.7 嗜酸乳杆菌微胶囊的耐酸性实验 取一定量未包被的菌体及微胶囊0.1g分别置于盛有50mL pH1.2人工胃液的三角烧瓶中37℃处理3h，每隔1h取样测存活率。

1.2.8 微胶囊肠溶性实验 取微胶囊0.1g置于盛有50mL pH6.8人工肠液的三角烧瓶中，37℃处理1h，每隔15min取样，测溶液在305nm处的吸光度值。

1.2.9 微胶囊稳定性实验 取冷冻干燥后的微胶囊在常温下贮存60d，每隔15d取样，测嗜酸乳杆菌存活率。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 海藻酸钠浓度对嗜酸乳杆菌存活率的影响实验选择2%氯化钙，4%脱脂奶粉，1%谷氨酸钠，海藻酸钠浓度为1%、2%、3%、4%条件下制备微胶囊，冷冻干燥后测菌体存活率，结果如图1所示。随着海藻酸钠浓度的增加，存活率增大，但当浓度大于3%时，存活率下降，这是因为，当海藻酸钠浓度过大时，体系粘度增大，阻塞针头，不易于挤出，造成菌体损失。

图1 海藻酸钠浓度对存活率的影响Fig.1 Effect of concentration of sodium alginate on survival rate

2.1.2 氯化钙浓度对嗜酸乳杆菌存活率的影响 实验选择2%海藻酸钠，4%脱脂奶粉，1%谷氨酸钠，氯化钙浓度为1%、2%、3%、4%条件下制备微胶囊，冷冻干燥后测存活率，结果如图2所示。随着氯化钙浓度的增加，存活率增加，原因是海藻酸钠分子链上含有大量的羟基和羧基，用氯化钙溶液作为交联剂，可形成交联的不溶于水的海藻酸钙聚合物，提高冻干存活率。

图2 氯化钙浓度对存活率的影响Fig.2 Effect of concentration of calcium chloride on survival rate

2.1.3 脱脂奶粉浓度对嗜酸乳杆菌存活率的影响 实验选择2%海藻酸钠，2%氯化钙，1%谷氨酸钠，脱脂奶粉浓度为3%、4%、5%、6%条件下制备微胶囊，冷冻干燥后测存活率，结果如图3所示，当脱脂奶粉的浓度小于5%时，随着脱脂奶粉浓度的增加存活率也增加，原因是乳清蛋白在细胞外形成保护膜并可以固定冻干的酶类，防止由于细胞壁损伤而引起的胞内物质泄漏。当达到6%时，存活率下降，可能是由于过多的脱脂奶粉造成溶液体系粘度增大，影响包埋效果，导致存活率下降。

图3 脱脂奶粉浓度对存活率的影响Fig.3 Effect of concentration of skim milk powder on survival rate

2.1.4 谷氨酸钠浓度对嗜酸乳杆菌存活率的影响实验选择2%海藻酸钠，2%氯化钙，4%脱脂奶粉，谷氨酸钠浓度为0.5%、1%、1.5%、2%条件下制备微胶囊，冷冻干燥后测存活率，结果如图4所示。当谷氨酸钠浓度小于1.5%时，随着谷氨酸钠浓度的增加存活率也增加，这是因为谷氨酸钠与糖类物质发生协同作用，增加干燥时基质的玻璃化转化温度，降低机械损伤的可能性，但当谷氨酸钠浓度为2%时，存活率下降，可能是谷氨酸钠与糖类物质玻璃化，体系粘度增大，不利于微胶囊挤出。

2.2 嗜酸乳杆菌微胶囊化的正交实验

图4 谷氨酸钠浓度对存活率的影响Fig.4 Effect of concentration of sodium glutamate on survival rate

在单因素实验结果的基础上，以海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、脱脂奶粉浓度、谷氨酸钠浓度为研究对象，采用L9(34)正交实验，以嗜酸乳杆菌存活率为评价指标，选择最佳配比。正交实验结果见表2。由表可知，影响嗜酸乳杆菌存活率因素的主次顺序是A(海藻酸钠浓度)＞B(氯化钙浓度)＞D(谷氨酸钠浓度)＞C(脱脂奶粉浓度)。确定最佳工艺为A3B2C1D3，即海藻酸钠浓度为3%，氯化钙浓度为2%，脱脂奶粉浓度为4%，谷氨酸钠浓度为1.5%。该工艺组合对应于表中的8号实验，由表可知，在此配比下嗜酸乳杆菌存活率为99.21%。

表2 正交实验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

2.3 钙离子浓度范围的确定

如图5所示，随着海藻酸钠混合液的滴入，钙离子浓度逐渐降低，降至1.62%后，通过观察发现微胶囊形态开始不均匀。挤压法固化的原理是将海藻酸钠滴入大量钙离子中，海藻酸根与钙离子结合，固化成海藻酸钙。传统的外源乳化法将少量海藻酸钠滴入大量钙离子中［7］，钙离子浓度变化忽略不计，为使氯化钙浓度随海藻酸钠混合液滴入而产生的变化更明显，本实验使海藻酸钠混合液体积为氯化钙溶液体积的2倍，测出微胶囊成囊效果最好的钙离子浓度范围。

2.4 嗜酸乳杆菌微胶囊耐酸性实验结果

图5 海藻酸钠体积对钙离子浓度的影响Fig.5 Effect of volume of sodium alginate on concentration of calcium chloride

如图6所示，经微胶囊化的嗜酸乳杆菌在人工胃液中处理3h，仍有60.8%的存活率，而未经微胶囊化的嗜酸乳杆菌则不耐酸，在人工胃液里1h后就死亡殆尽。说明本实验制备的微胶囊能够耐受胃酸的破坏，具有耐酸性。

图6 微胶囊人工胃液中的存活率Fig.6 The survival rate of microcapsule in artificial gastric juice

2.5 嗜酸乳杆菌微胶囊的肠溶性实验结果

如图7所示，305nm处的吸光度值在30min后基本稳定，且通过肉眼观察可知，在人工肠液中处理30min后，溶液中已经基本不含固体颗粒，可以确定乳杆菌微胶囊在人工肠液中处理30min后已经完全崩解。说明本实验制备的乳杆菌微胶囊具有较好的肠溶性。

图7 微胶囊在人工肠液中的释放结果Fig.7 The dissolved results of microcapsule in artificial intestine fluid

2.6 嗜酸乳杆菌微胶囊的稳定性实验

如图8所示，制备的嗜酸乳杆菌微胶囊在室温存放过程中，其存活率下降缓慢，至60d时存活率为59.6%。而未进行微胶囊化的乳杆菌在室温下贮存至15d时，其存活率便降到0。说明微胶囊包被能增强嗜酸乳杆菌在室温下贮存的稳定性。

图8 贮存时间对存活率的影响Fig.8 Effect of storage period on survival rate

3 结论与讨论

挤压法有两点不足之处，首先，细胞在胶粒中分布不均，大部分集中在胶粒的空隙和表面，胶粒中心的细胞数量很少;其次，胶粒表面的细胞易释放，不能阻隔胃液，产品不具备耐酸性［8］。本实验将挤压法与冷冻干燥结合提高微胶囊中活菌含量及耐酸性。谷氨酸钠和脱脂奶粉是常用的乳酸菌冷冻干燥保护剂［9］。谷氨酸钠分子量小，能透过细胞壁渗透到细胞内部，在干燥过程中可与海藻糖形成一种粘性玻璃态，因而分子扩散系数降低，蛋白质结构稳定，机械损伤减少从而起到保护作用，亦有利于延长货架期［10］，且其效果优于乳糖，宁豫昌等［11］以乳糖为冻干保护剂制备的乳杆菌微胶囊贮存2个月后，乳杆菌存活率仅为30%，而本实验制备的乳杆菌微胶囊贮存2个月后，乳杆菌存活率为59.6%。脱脂奶粉中的乳蛋白在菌体外形成保护层，可防止因细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏［12］，但是如果浓度超过5%体系粘度过大则影响包埋效果。单因素实验证明存活率与氯化钙浓度成正比，但是当氯化钙浓度过高时，微胶囊硬化过度不利于破壁，导致微生态制剂的肠溶性降低。

一般生产中将少量海藻酸钠滴入大量钙离子中，与钙离子络合形成凝胶聚集体海藻酸钙［13］，钙离子浓度的变化可以忽略不计，但造成了钙离子的浪费。本实验以EDTA滴定法测定钙离子浓度，确定钙离子浓度范围在1.62%至2%时，成囊效果最好。工业化过程中可以保持海藻酸钠等混合液的滴入速度一定，确定时间与钙离子浓度的关系，定时补充氯化钙。

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