鸭蛋腌制前后于低频波段的阻抗特性研究

郑应家，王浩月，杨 哪，金亚美，王金鹏，徐学明，金征宇，*

(1.江南大学食品学院，江苏无锡214122;2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;3.通标标准技术服务(上海)有限公司，上海200233)

生物电学阻抗技术(Electrical Bio－impedance Measuring Technology)作为一种电化学技术，可对生物组织与器官的电学特征进行检测，不同的生物体组织由于内外液体和盐分含量以及不同蛋白组分的内外电荷分布差异造成了阻抗特性的不同［1－3］。借助驱动电极向检测对象输入微小的交变电信号，同时测量响应信号并计算出阻抗，以便获取相关生理学信息［4］。长久以来，对生物组织电学阻抗特性的研究，一直是生理学和生物医学工程的关注热点，在农产品领域则作为一种非损伤性检测技术得到广泛研究，其检测原理包括生物组织的R－C等效电路模型、Cole－Cole理论和 Schwan的频散理论。张爱萍［5］等研究了牛奶的总阻抗、双电层电容、阻抗角等参数并发现以总阻抗作为检测参数得到的菌落总数值符合实际情况;林荣生［6］通过电路模型分析发现生物活化的微珠、微叉指电极之间的电容、溶液的电阻对电化学阻抗传感单元的输出特性有显著影响;胡珂文等［7］研究了1Hz～1MHz下牛奶中微生物阻抗的变化情况;丁强等［8］提出了阻抗技术在肉制品理化指标检测方面的应用;马青等［9］研究了家兔红细胞的阻抗特性和等效电路并发现多个特性频率。咸蛋是中华传统美食，作为一个复杂的电介质体系，鸭蛋在腌制前后其蛋清和蛋黄的含水量、出油率、盐分等变化都影响其阻抗特性。目前未见详尽的咸蛋电学阻抗特性研究数据发表，本文通过对鸭蛋腌制过程中阻抗特性的研究建立一个可行的评价方法，对于食品机械和分析检测仪器的研究有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭蛋 取无锡大润发超市鸭蛋70枚(60g左右);精密阻抗分析仪、阻抗测试治具 1011J Precision Impedance AnalyZer 65120B，Wayne Kerr，英国。

1.2 实验方法

1.2.1 鸭蛋腌制 将新鲜鸭蛋洗净、标记，水烧开后配制浓度为20%的食盐水，放置冷却后，将配好的溶液与适量的草木灰混合调稀，裹在鸭蛋的表面约5mm厚，再裹上一层约3mm厚的干草木灰，裹好后用保鲜膜密封，18℃放置，每周测量其水分、盐分、蛋黄出油率、蛋黄硬化率、蛋白质种类理化参数，腌制6周。

1.2.2 阻抗特性测试 采用精密阻抗分析仪和平行板(圆形)阻抗测试治具1J1011测量液体阻抗特性。取蛋清、蛋黄各1g，分别置于平行板阻抗治具中，测试直径18mm、厚度1mm。由精密阻抗分析仪计算出物料的阻抗幅值和相位角。本阻抗分析仪可提供范围(100Hz～12MHz)间200个频率点下的阻抗特性值，取平均值，采用ZSimpWin软件进行数据处理。测试前分别用空气、标准电容和电阻对阻抗治具在所测频率区间进行开路和短路校准，然后运行并记录数据。

1.2.3 蛋品盐分含量测定 以氯化钠含量计，采用硝酸银滴定法测定［10］。

1.2.4 蛋黄硬化率测定［11］用滤纸将咸蛋清和咸蛋黄分离，蛋黄称重记录质量W0，然后用小刀挖去蛋黄内部软的部分，剩下的硬蛋黄部分称重记录质量W1，蛋黄硬化率(%)=W1/W0×100。

1.2.5 蛋黄出油率测定［11］称取3g蛋黄在35mL的正己烷和异丙醇(3∶2，体积比)混合，均质5000r/min下10min，然后滤液通过滤纸收集后，于55℃蒸发掉溶剂，105℃干燥恒重，残渣质量W0作为总的脂肪含量。浸出油量测定是采用5g咸蛋黄与25mL去离子水混合在5000r/min下均质30s，匀浆在25℃ 9000r/min下处理40min，然后在上清液添加25mL的正己烷和异丙醇(3∶2体积比)溶解掉悬浮体。有机溶剂－脂相层通过分液漏斗获取，于55℃下旋转蒸发，剩下的105℃干燥恒重，残余质量W1作为浸出游离油脂。

1.2.6 SDS－PAGE凝胶电泳对蛋黄和蛋清蛋白质种类测定［12］制备12%的分离胶和5mL的浓缩胶，取咸蛋清和咸蛋黄各0.0008g于1mL离心管中，加样品处理液80μL，加热5min，振荡混合，确保溶解，在转速5000r/min下离心10min。样品处理好后加样，在15mA条件下跑胶。结束后将胶体置于去离子水中保存，用凝胶电泳成像仪拍出清晰度和大小合适的照片并保存。

2 结果与讨论

2.1 鸭蛋腌制前后蛋清与蛋黄的等效电路模型构建

凝胶电泳图中蛋白质条带位于不同的位置与蛋白质本身的分子量和所带电荷量有关，由此原理在构建电路模型时，以不同条带区域的蛋白质代表一种单元电路进行模拟。从图1可知，腌制前后鸭蛋蛋白质种类变化不大，这一结论和Thammarat的研究相同［11］。蛋清蛋白质主要有45ku区间的卵白蛋白、36ku区间的卵清蛋白和18ku区间的卵类粘蛋白，而卵类粘蛋白属于混合物，含溶酶菌、卵蛋白酶抑制物、卵糖蛋白等［11］。因不同蛋白质界面形态和所带净电荷的差异，蛋白质不是理想的电阻或电容，本文假定蛋白质作为一个纯电阻R和常相位角元件Q的串联电路，常相位角元件指数n=1时，可表示为纯电容，n=0则常相位角元件表示纯电阻［13］，其中0＜n＜1。蛋清和蛋黄属于不同分子量蛋白质的分散体系，相互成团聚集［14］，本文构建等效电路时将每个蛋白质单元电路的常相位角元件Q部分与另一个蛋白质单元电路的并联看待，鲜蛋清和咸蛋清等效电路模型都可以看成蛋清常相位元件QW、蛋清电阻RW、卵白蛋白电阻RO、卵白蛋白常相位元件QO、卵清蛋白电阻RC、卵清蛋白常相位元件QC、卵类粘蛋白电容COV、卵类粘蛋白电阻ROV和蛋白质漏电阻RWM组成，等效电路图和电路码如图2。蛋黄作为一个复杂的生物体系而含有不同分子量的脂蛋白且腌制前后蛋白质种类无差异，造成条带位置差异可能由于脂蛋白的脱水作用造成［11］，故将鲜蛋黄和咸蛋黄作为一种等效电路模型研究。同理对此电路网络可以把相近分子量36ku区间的卵黄高磷蛋白为常相位角元件QP和其电阻RP，43ku区间的高密度脂蛋白可作为QH和RH，66～100ku区间的低密度脂蛋白作为CL和R［11］L，而蛋黄整体可以看为一个蛋黄体电容QY，蛋黄体电阻RY的串联，所有蛋白质漏电阻为RYM，则电路图和电路码如图3所示，拟合参数如表1所示。

图1 鸭蛋腌制前后蛋清和蛋黄凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of duck egg white and yolk before and after salting

2.2 鸭蛋腌制前后蛋清和蛋黄阻抗特性研究

从蛋清和蛋黄的Bode图(图4)、复导纳图(图5)和R/I图(图6)可看出构建的等效电路和蛋清蛋黄实际阻抗特性曲线的拟合情况，其中Chi squared越小越好，图示中MSD为样品实际测量值，Calc为等效电路拟合值。图4为蛋清和蛋黄在腌制前后的相频和幅频曲线即为Bode图，可以看出蛋清和蛋黄的阻抗幅值都随频率的提高而降低，而咸蛋清和咸蛋黄的阻抗值整体低于鲜蛋清和咸蛋黄的阻抗值，这是因为咸蛋清和咸蛋黄的NaCl离子含量高，导电性增加。由相位角特性可以看出在激励信号下，通过体系的电压信号落后于电流信号的时间［15－16］。鲜蛋清的相位角转折频率为2.859kHz，咸蛋清的相位角转折频率为426Hz，蛋清的相位转折频率都在低频区域可能为α散射，通常发生在音频区域(几Hz到十几千Hz)，反映体系细胞蛋白质界面离子层引起的介电弛豫现象［17］，此段频率电场下的蛋清和蛋黄具有较高绝缘性和较低导通性，即低频段反映细胞蛋白质外部的电学信息。鲜蛋黄的相位转折频率为3.603、102.2、2.859、5.273MHz，而咸蛋黄则无相位转折频率，可能是盐分导致蛋黄脱水，脂蛋白中的油脂和载脂蛋白分离造成的电学特性差异。其中5.273MHz可能为鲜蛋黄的β散射频率，位于几十千Hz到几十万Hz区间，反映了细胞蛋白质界面和其内部的容抗特性随电场频率的变化规律，即细胞蛋白质作为电容的充、放电介电弛豫过程，具有低绝缘性和高导通性，体现细胞蛋白内部对电场的响应特性［18］

表1 腌制前后蛋清和蛋黄等效电路拟合参数Table 1 Equivalent circuit fitting parameters of duck egg white and yolk before and after salting

图2 腌制前后蛋清的等效电路模型与电路码Fig.2 Equivalent circuit model and circute discription code of duck egg white before and after salting

图3 腌制前后蛋黄的等效电路模型与电路码Fig.3 Equivalent circuit model and circute discription code of duck egg yolk before and after salting

图4 腌制前后蛋清和蛋黄的Bode图Fig.4 Bode plot of duck egg white and yolk before and after salting

图5为蛋清和蛋黄的复导纳图，代表阻抗实部和虚部倒数在不同频率下的特性半圆曲线，可以看出各自的特征频率的变化，鲜蛋清为137.7kHz;咸蛋清为 13.43kHz;鲜蛋黄为 265.9kHz;咸蛋黄为1.776kHz，可知蛋清和蛋黄腌制后的特征频率都向音频范围移动。

图5 腌制前后蛋清和蛋黄的复导纳图Fig.5 Complex admittance plot of duck egg white and yolk before and after salting

由图6可知，鲜蛋清和咸蛋清阻抗虚部绝对值与实部随频率升高呈现单调递减趋势，鲜蛋清的阻抗实部和虚部绝对值相近，但咸蛋清的虚部绝对值大于实部，虚部为电抗代表材料对交流电的阻碍作用，咸蛋清对交流电信号的阻碍作用弱于鲜蛋清。蛋黄的阻抗各部都随频率升高而整体趋于递减，阻抗虚部绝对值低于实部，鲜蛋黄阻抗虚部有处转折峰f=44.3kHz，这一特征与蛋清相反，这也可能与盐分含量和脂蛋白分离有关，此转折频率在之前的Bode图和复导纳图中未出现，原因有待进一步分析。

2.3 鸭蛋腌制前后蛋清和蛋黄阻抗特性与理化指标相关性

图6 腌制前后蛋清和蛋黄的R/I图Fig.6 R/I plot of duck egg white and yolk before and after salting

将表2和表3中各频率下的阻抗值和相位角与各理化指标进行回归分析发现，只有当激励信号为102Hz时，阻抗值与蛋清和蛋黄的部分理化指标的回归方程较显著，其中X－阻抗幅值，Ω:

蛋清盐分和阻抗值的二项式回归拟合方程为:y=－0.0076X2+0.4421X+7.933，R2=0.9412;

蛋黄盐分和阻抗值的三项式回归拟合方程为:y=－4e－6X3+0.0013X2－0.147X+6.3242，R2=0.9515;

蛋黄硬化率和阻抗值的线性回归拟合方程为:y=－0.2428X+97.214，R2=0.9574;

蛋黄出油率和阻抗值的二项式回归拟合方程为:y=0.0035X2－0.7424X+53.264，R2=0.9524;

由此可知，低频区域的各频率点下其阻抗值对鸭蛋腌制过程中的盐分含量、出油率和硬化率都具有较显著的预测效果，而随频率的升高则在单个频率点下的不同腌制时间蛋清和蛋黄的阻抗值与相位角并无规律性变化，这一特点对研制咸蛋品理化指标的检测具有参考价值。同样张军等［19］通过采用混合式电极在激励频率591Hz下发现鱼体阻抗特性与化学指标TVBN有良好的回归显著特性，从而可预测鱼肉的新鲜度。

表2 不同激励频率下咸鸭蛋在腌制过程中的阻抗幅值和相位角Table 2 Impedance amplitude and phase angle changes of salted duck egg at different frequency in the process of salting

表3 咸鸭蛋于18℃腌制过程中的理化指标Table 3 Physical and chemical indexes of salted duck egg in the process of salting at 18℃

3 结论

采用生物阻抗技术对鸭蛋腌制期间的阻抗特性变化进行了研究，通过凝胶电泳对腌制前后蛋清和蛋黄的蛋白质定性并建立了等效电路;研究了腌制期间蛋清和蛋黄100Hz～12MHz频域的Bode图、复导纳图、实部虚部图确定了特征频率和各自可能的散射类型;在低频102Hz下蛋清和蛋黄在腌制过程中的盐分含量、出油率和硬化率都与阻抗幅值有较显著的回归特性。在前期研究中，通过对腌制的鸡蛋、红心鸭蛋(饲料蛋)、普通农家鸭蛋的阻抗特性研究，发现各自的阻抗谱图形几乎无任何差异，故还无法进行该类的定性辨别。这是因为蛋品里面的各类脂蛋白和蛋清蛋白种类与分子量相差不大，而阻抗特性只能反映材料的电学性质和一些宏观理化参数变化，所以对成分中不同分子含量和种类差异这样的微观性质还无法进行揭示。

［1］Toyoda K.Impedance spectroscopic analysis in agricultural products［M］.Developments in food engineering，Blackie A ＆ P，Part1，1994:143－145.

［2］Stout D G.Effect of cold acclimation on bulk tissue electrical impedance I Measurement with birdfoot trefoil at subfreezing temperature［J］.Plant Physioloy，1988，86:275－282.

［3］Damez J L，Clerjon S，Abouelkaram S，et al.Beef meat electrical impedance spectroscopy and anisotropy sensing for non－invasive early assessment of meat ageing［J］.Journal of Food Engineering，2008，85(1):116－112.

［4］Gudrun O，Paul N，Corrado D，et al.Multisensor for fish quality determination［J］.Trends in Food Science and Technology，2004，15:86－93.

［5］张爱萍，孟瑞锋，侯式娟，等.阻抗法快速分析牛奶中的菌落总数［J］.中国食品学报，2012(2):158－164.

［6］林荣生.基于抗体微阵列的食源性病原体综合检测平台［J］.食品工业科技，2011，32(12):489－493.

［7］胡珂文，盖玲，叶尊忠，等.阻抗谱测量在微生物快速检测研究中的应用［J］.中国食品学报，2009，9(3):162－167.

［8］丁强，王忠义，黄岚，等.生物阻抗技术及其在肉品质检测中的应用［J］.传感器与微系统，2009，28(3):4－7.

［9］马青，洲崎敏伸.家兔红细胞阻抗谱的实验和等效电路拟合研究［J］.中国生物医学工程学报，2006，25(5):566－570.

［10］韩雅珊.食品化学实验指导［M］.北京:中国农业大学出版社，1996.

［11］Thammarat K，Soottawat B，Wonnop V.Changes in chemical composition physical properties and microstructure of duck egg as influenced by salting［J］.Food Chemistry，2009，112:560－569.

［12］田亚平 .生化分离技术［M］.北京:化学工业出版社，2006.

［13］Sen Y，Carmendel R，Lopez G，et al.Impedance spectroscopy of cross－linked new naphthalenic polyimide acid membranes［J］.J Phys Chem，2010，114:22773－22782.

［14］Vassilios R，Rasmus H，Lydia C，et al.Separation and identification of hen egg protein isoforms using SDS－PAGE and 2D gel electrophoresis with MALDI－TOF mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2006，99:702－710.

［15］Chiabrea A，Nicolini C，Schwan HP.Interaction between Electromagnetic Fields and Cell［M］.Plenum，New York，1985:83.

［16］Uwe P.Bioimpedance:A review for food processing［J］.Food Eng Rev，2010(2):74－94.

［17］Duck F A.Physical properties of tissue［M］.London:Academic Press，1991:167－168.

［18］Brago R，Gamez X，Cairo J，et al.Biomass monitoring using impedance spectroscopy［J］Ann New York Acad Sci，299－305

［19］张军，李小昱，王为，等.用阻抗特性评价鲫鱼鲜度的实验研究［J］.农业工程学报，2007，23(6):44－48.