非小细胞肺癌组织中PTEN基因与Ki67蛋白的表达及其意义

纪勇，张梓威，陈静瑜，郑明峰，吴小波，卫栋

(南京医科大学附属无锡市人民医院心胸外科，江苏无锡 214023)

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率呈明显上升趋势。磷酸酶-张力蛋白酶(PTEN)基因定位于染色体10q23，是迄今为止人类发现的第一个具有磷酸化酶功能的抑癌基因［1-2］。作为磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/丝-苏氨酸激酶(AKT)通路的负调控因子，PTEN基因的正常表达可以抑制细胞的恶变以及肿瘤细胞侵袭、转移、生长，该基因异常突变将导致其抑癌作用缺失，与肿瘤的发生密切相关［3-4］。Ki67是与细胞增殖相关的核抗原，与肿瘤增殖、侵袭性密切相关［5］。本研究通过免疫组化法检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织及其癌旁正常肺组织中PTEN和Ki67蛋白的表达，并结合临床及病理学特征进行分析，旨在探讨二者在NSCLC中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

67例手术标本取自我院2009年6月至2011年5月收治的肺癌患者，并经术后病理诊断证实为NSCLC。其中男33例，女34例，年龄39～80岁，平均(61±4)岁。所有病例按照国际抗癌联盟(UICC)的诊断标准进行病理分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例;鳞癌28例，腺癌3l例，大细胞癌8例;低分化25例，高、中分化42例;有淋巴结转移者29例，无转移者38例。同时选取距肿瘤组织＞5 cm的41例正常肺组织作为对照。全部病例术前均无放疗和化疗。

1.2 试剂与方法

抗体、S-P试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。切除标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，蜡块以4 μm连续切片，分别进行免疫组化和HE染色。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法):二甲苯透明，微波抗原修复;0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，分别滴加Ki67和PTEN一抗;于4℃冰箱中过夜，依次滴二抗及链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染，分化、脱水、透明封片。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

PTEN、Ki67在细胞中出现棕黄色细颗粒为阳性细胞。根据染色阳性的细胞数占总细胞数的百分比判断:阳性率＜5%者为阴性;5%～20%为阳性(+)，＞20%者为强阳性(++)，定义(+)以上为阳性表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0统计学分析软件包进行统计分析，运用χ2检验、Spearman等级相关分析等进行统计学处理，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 NSCLC及癌旁正常肺组织中PTEN和Ki67的表达

PTEN的阳性表达为胞浆内存在不同染色程度的棕黄色颗粒，胞核亦有少量表达。PTEN在癌组织及癌旁正常组织中均有表达，但在癌组织中的失表达率(67.16%)明显高于正常肺组织(17.07%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。Ki67的阳性染色表现为细胞核着棕黄色，在癌组织中的失表达率(76.12%)亦明显高于正常组织(7.31%)，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见图1、表1。

2.2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表达与临床病理特征的相关性

不同性别、年龄组PTEN和Ki67的表达差异无统计学意义(P＞0.05);PTEN和Ki67的表达与组织类型、分化程度及有无淋巴结转移的相关关系:随肿瘤分化程度的升高，PTEN表达逐渐升高，而Ki67的表达呈逐渐降低;PTEN阳性表达与淋巴结的转移率呈负相关，而Ki67蛋白表达与淋巴结转移率呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05);PTEN和Ki67的表达与肿瘤的位置、大小等无关(P＞0.05)。见表2。

2.3 NSCLC中PTEN表达与Ki67表达的相关性

NSCLC组织中PTEN和Ki67表达水平呈负相关(r= －0.627，P=0.021)，见表3。

3 讨 论

图1 PTEN在非小细胞肺癌(腺、鳞癌)中的阳性表达(A、B)及Ki67在非小细胞肺癌(腺、鳞癌)中的阳性表达(C、D) ×200Fig 1 PTEN(in brown)is expressed in cytoplasm of NSCLC A(adenocarcinoma)，B(squamous carcinoma);Ki67(in brown)is expressed in nuclei of NSCLC C(adenocarcinoma)，D(squamous carcinoma) ×200

表1 PTEN和Ki67在NSCLC及癌旁正常肺组织中的表达例Tab 1 Expression of PTEN and Ki67 in NSCLC and adjacent normal lung tissues case

PTEN是1997年首先被发现的具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，含有1 209个核苷酸，编码由403个氨基酸组成、相对分子质量为47 000、位于细胞浆的蛋白质，即酪氨酸磷酸酯酶［6］。PTEN编码的磷酸酯酶通过阻断PI3K/蛋白激酶B通路，使局灶性黏着斑激酶去磷酸化，下调Ras介导的丝裂酶原激活蛋白激酶活化，进而调控细胞周期，并对细胞增殖、浸润和迁移等多方面起调控作用［7-9］。Yoshimoto等［10］对前列腺癌的研究显示，PTEN基因在前列腺癌中的突变率为43%。本研究显示，PTEN在癌旁正常组织中的缺失或低表达率高于肺癌组织，表明PTEN可能参与了肺癌的发生，其缺失或低表达，可能导致肺组织上皮突变和过度增殖，从而形成肿瘤［11］。肺鳞癌PTEN基因的阳性表达较其他类型低，在不同分化程度的肺癌组织中，PTEN基因的表达同样有差异。本研究表明，在肺腺癌、鳞癌、大细胞癌组织标本中，分化程度越低，PTEN基因阳性表达率越低，低分化组与高、中分化组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示PTEN基因的缺失与肿瘤的分型和恶性分化程度亦具有相关性。

Ki67是Gerdes等在1983年报告的一种单克隆抗体，是从L428细胞系抽取物免疫小鼠过程中获得的，其基因位于10号染色体(10q25)上，由分子质量为345 kD和395 kD的两条多肽链组成，其抗原是一种与细胞增殖相关的核蛋白。研究表明，Ki67表达主要位于核内，其功能与染色质相连，可能与细胞有丝分裂和细胞周期相关，能够反映细胞的增殖活性［12-15］。因此，本研究试图通过检测Ki67在肺癌组织中表达，判断其与肿瘤的恶性生物学特性的相关性。结果显示:NSCLC与癌旁正常肺组织中均有Ki67增殖抗原表达，Ki67蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，说明Ki67增殖抗原能间接反映恶性肿瘤的无限增殖活性。本组研究中，淋巴结转移组Ki67的表达高于无淋巴结转移组;TNM分期中Ⅲ期的Ki67阳性表达高于Ⅰ、Ⅱ期;低分化组表达高于高分化组。Ki67的表达可能与肿瘤的浸润转移、临床分期和分化程度有关。

表2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表达与临床病理特征之间的相关性 例Tab 2 Correlation of expression of PTEN and Ki67 in NSCLC with clinicopathologic features case

表3 NSCLC中PTEN表达与Ki67表达的关系 例Tab 3 Correlation of the expression of PTEN with Ki67 in NSCLC case

此外，本研究也分析了NSCLC组织中PTEN、Ki67表达的相关性，表明二者的表达存在显著负相关关系。PTEN表达水平越低、Ki67表达越高，则肿瘤组织细胞增殖越活跃、分化程度越低，患者预后差。因此，联合检测PTEN和Ki67对于判断NSCLC的恶性程度和预后具有一定的临床意义。

［1］LEE S，CHOI E J，JIN C，et al.Activation of PI3K/Akt pathway by PTEN reduction and PIK3CA mRNA amplification contributes to cisplatin resistance in an ovarian cancer cell line［J］.Gynecologic Oncology，2005，97:26-34.

［2］GOMES C P，ANDRADE L A.PTEN and p53 expression in primary ovarian carcinomas:immunohistochemical study and discussion of pathogenetic mechanisms［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16:254-258.

［3］LEONARDO E，VOLANTE M，BARBARESCHI M，et al.Cell membrane reactivity of MIB-1 antibody to Ki67 in human tumors:fact or artifact［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(2):220-223.

［4］陈昊，李玉民，何明彦，等.胃不典型增生和癌组织中Ki67和PTEN蛋白的表达及意义［J］.中国普外基础与临床杂志，2007，3:304-307.

［5］谷化平.CD44v6和 E-cadherin表达与肺癌的关系［J］.东南大学学报:医学版，2010，29(2):203-205.

［6］陈雪松，赵艳滨，蔡莉，等.血管紧张素 II受体1、VEGF和PTEN在乳腺癌中的表达及临床意义［J］.中国肿瘤，2008，17(3):230-232.

［7］van RIJN S J，GRINWIS G C，PENNING L C，et al.Expression of Ki-67，PCNA，and p27kip1 in canine pituitary corticotroph adenomas［J］.Domest Anim Endocrinol，2010，38(4):244-252.

［8］WANG Y，WANG X，ZHANG J，et al.MicroRNAs involved in the EGFR/PTEN/AKT pathway in gliomas［J］.J Neurooncol，2012，106(2):217-224.

［9］张航，钱科卿，闵海燕，等.PTTG和bFGF在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.东南大学学报:医学版，2009，28(3):217-221.

［10］YOSHIMOTO M，CUTZ J C，NUIN P A，et al.Interphase FISH analysis of PTEN in histologic of sections shows genomic deletions in 68%of primary prostate cancer and 23%high-grade prosraticintra-epithelial neoplasias［J］.Cancer Genet Cytogenet，2006，169:128-137.

［11］GALLARDO A，LERMA E，ESCUIN D，et al.Increased signalling of EGFR and IGF1R，and deregulation of PTEN/PI3K/Akt pathway are related with trastuzumab resistance in HER2 breast carcinomas［J］.Br J Cancer，2012，106(8):1367-1373.

［12］KINROSS K M，MONTGOMERY K G，KLEINSCHMIDT M，et al.An activating Pik3ca mutation coupled with Pten loss is sufficient to initiate ovarian tumorigenesis in mice［J］.J Clin Invest，2012，122(2):553-557.

［13］张全安，徐瀚峰.非小细胞肺癌LRP、c-erbB-2蛋白表达与辅助化疗疗效相关性的研究［J］.东南大学学报:医学版，2008，47(6):451-453.

［14］GONZALEZ-MOLES M A，RUIZ-AVILA I，GIL-MONTOYA J A，et al.Analysis of Ki-67 expression in oral squamous cell carcinoma:why Ki-67 is not a prognostic indicator［J］.Oral oncology，2010，46(7):525-530.

［15］DOWSETT M，NIELSEN T O，A'HERN R，et al.Assessment of ki67 in breast cancer:recommendations from the international Ki67 in breast cancer working group［J］.J Nati Cancer Inst，2011，103(22):1656-1664.