基于光子悬浮列阵多元检测肿瘤标志物的初步研究

卢颖辉，何杰，田小强，常立功，黄培林

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009;2.安徽医科大学附属省立医院 病理科，安徽合肥 230000)

由于单个标志物往往不能准确诊断某种肿瘤，所以研发新型具有高通量联合检测多种肿瘤标志物的方法就显得格外重要。目前常用的传统的肿瘤标志物检测方法常只能检测单个肿瘤标志物，在需检测多个标志物时会造成资源浪费［1-2］。相对于传统的检测方法，多元检测技术具有高通量、高灵敏度、节省待测样本、缩短检测时间、降低检测成本等优势［3］。

本研究采用基于胶体晶体微球编码载体的多元检测技术检测肿瘤标志物。这种微列阵的载体是二氧化硅胶体晶体微球(silica crystal colloidal spheres，SCCBs)。这些载体的编码是源于它们结构周期性的特有的反射峰，所以不会有诸如褪色、漂白、粹灭以及化学不稳定等问题［4-5］。另外，由于没有染色和与荧光相关的物质存在，所以SCCBs的背景很低［6-7］。在本研究中，我们在成功构建SCCBs微列阵的基础上，应用双抗夹心法对人胶质瘤细胞株蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白进行检测。检测结果与传统ELISA方法进行比对，初步探讨基于SCCBs的微列阵多元检测技术的可行性、高通量及其高灵敏度等特点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胶质瘤细胞株SHG-44由苏州大学提供，DMEM高糖培养基在细胞恒温培养箱培养。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人Bcl-2抗体、鼠抗人p21抗体、异硫氰酸荧光素(FITC标记)标记的二抗均购自BD公司，牛血清蛋白(BSA)购自Sigma公司，5%的PBS缓冲液(pH 7.4)、SCCBs由东南大学生物电子国家重点实验室提供，细胞裂解液以及CBA蛋白定量试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，人Bcl-2、p21蛋白ELISA试剂盒均购自南京迪尧生物技术公司。

1.1.3 主要仪器 金相显微镜(OLYMPUS BX51)、荧光倒置显微镜(OLYMPUS IX71)、高灵敏度彩色CCD摄像头(Evolution MP 5.0)、高灵敏度冷CCD(DP30)、光纤光谱仪(USB2000-FLG，QE65000)、细胞恒温培养箱、酶标仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 构建SCCBs悬浮微列阵 通过预实验摸出最合适的时间和温度，标记上探针，构建最佳状态的悬浮微列阵。探针分子是通过共价结合固定在SCCBs表面的。首先，SCCBs作亲水处理，在浓硫酸与双氧水7∶3的溶液中浸泡48 h，用纯水洗干净，烘干后用10%的G-PTMS甲醛溶液浸泡过夜，分别用甲醛和乙醇溶液洗，然后用纯水洗干净。SCCBs标探针。本研究用的10 μl体系每管都是10 μl、5 个微球。将10 μl的一抗加到EP管里，4℃过夜。

1.2.2 免疫检测 应用双抗夹心法，首先用不同浓度的蛋白标准液测量标准曲线;再用同一条件的微列阵定量检测从人胶质瘤细胞提取的总蛋白中的Bcl-2、p21蛋白。检测在同一试管中进行。

将孵育过夜的微球用PBS缓冲液洗3～4遍，每次5 min;加5%的BSA蛋白溶液封闭2 h，条件是37℃振荡摇匀;封闭过后的微球要用PBS缓冲液洗4～5遍，每次5 min;再加待测蛋白标准品或者细胞蛋白样品孵育30 min，37℃振荡摇匀;标准品的配制与样品的稀释都用PBS缓冲液;然后用PBS缓冲液洗4～5遍，每次5 min;洗完后孵育 FITC标记的二抗30 min，37℃振荡摇匀;孵育过后用PBS缓冲液洗4～5遍，每次5 min。在荧光显微镜下观察并记录荧光。

在进行多元肿瘤标志物检测时，不同编码的SCCBs表面固定各自的探针分子，并被混合在一起置于同一试管内。

ELISA检测，绘制标准曲线，分别检测蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白，所有实验重复3次以上。

1.3 统计学处理

使用SPSS统计软件分析，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 基于SCCBs的悬浮列阵的构建

如图1所示，5种光子 SCCBs的反射峰分别是447、510、562、592 和 617 nm，我们从 5 种微球中选出两种反射峰居中而又有一定差别的微球(微球反射峰分别是510、592 nm)用于下一步研究。

图1 5种微球的光谱图Fig 1 Reflection spectra of the five kinds of SCCBs

2.2 用悬浮微列阵方法绘制标准曲线

用悬浮微列阵方法检测得到Bcl-2和p21的线性范围分别是9 ～180 ng·ml－1和0.05 ～1 ng·ml－1。

图2、3为Bcl-2、p21蛋白的浓度标准曲线。跟传统的免疫分析结果一致，呈现非线性，将其进行曲线拟合处理。结果分析显示，以上两种肿瘤标记物的检测下限(信噪比为3σ)分别为1 ng和0.049 ng。基于SCCBs载体的多元检测方法在肿瘤分析中的灵敏度以及检测范围适合临床应用。

图2 Bcl-2的浓度与荧光强度关系曲线图Fig 2 Calibration plots of fluorescence intensity vs Bcl-2 tumor marker concentrations

图3 p21的浓度与荧光强度关系曲线图Fig 3 Calibration plots of fluorescence intensity vs p21 tumor marker concentrations

2.3 样品检测结果

对30份细胞总蛋白样本进行检测并对每个标记物检测的数据进行线性回归分析，得到如图4所示的分析结果关系图。由图中我们可以发现，基于SCCBs编码载体所获得的肿瘤标记物检测结果和商业化方法获取的检测结果具有较高的一致性。结果如下所示(x列:ELISA;y列:光子悬浮列阵):

p21:y=0.928 1x+0.110 7(R2=0.988 9)

Bcl-2:y=0.951 7x+5.403(R2=0.988 6)

图4 基于SCCBs载体技术和ELISA样本检测结果 横坐标为ELISA检测结果，纵坐标为光子悬浮阵列技术检测结果Fig 4 Correlation between the photonic suspension array and the standard ELISA method for the two tumor marker

这些数据进一步证明了我们开发的多元检测技术与传统的检测方法一样具有较好的分析可靠性。另外，基于SCCBs编码载体的检测方法消耗更少的样品量，并可以在同一试管内完成两种肿瘤标记物的检测，极大地简化了免疫检测过程。

3 讨 论

肿瘤标记物的检测在癌症的早期筛查、正确分型、治疗评估及预后、复发预测等方面具有重要意义，特别是多种肿瘤标记物的联合检测，对临床肿瘤的准确诊断至关重要［8-10］。目前常用的有效的检测方法只能分别检测某一种肿瘤标记物，常无法准确反映疾病的本质，临床应用价值有待进一步探讨。目前所采用的多元检测的方法各式各样，但是大多都是基于生物分子的固定和识别。为了同时区分不同的检测事件，生物分子必须被编码。但是生物探针分子的这种编码其位置或者坐标必须是固定的，靶分子要到达探针分子位置并与之反应，这一过程受扩散速度的限制，因此这会影响靶分子和探针分子的反应速度，令检测所需时间延长［11-12］。

近年来，将探针分子固定在微球表面的微列阵技术为多元检测提供了巨大的技术支撑［13-14］。在本研究中，利用基于SCCBs编码载体的多元检测技术检测肿瘤标记物，我们首先优化了肿瘤标记物探针分子在SCCBs表面的固定条件及微球表面探针与标记物反应的条件，提高了检测灵敏度。我们研究了物理吸附的方法和化学偶联的方法，结果发现，SCCBs高温处理后其亲水效果明显，可以被水完全浸润，这就导致了以疏水作用为主的探针分子在微球表面物理吸附的效率低下。另外，探针分子在微球表面吸附的变异系数也较高，导致检测结果缺乏准确性。相比而言，以化学偶联法在微球表面固定探针分子具有更高的稳定性及固定效率。从微球大小和反应时间等方面进行优化，我们发现，微球的荧光强度在孵育了30 min之后达到饱和。在反应时间方面，这种微列阵的双抗夹心免疫孵育时间比传统ELISA方法的1～3 h短很多，这是因为SCCBs有很高的比表面积，使免疫反应速度大大提高。在检测所需要样品的量方面，由于基于SCCBs的微列阵是在一个试管内同时检测两种微球，所以每管检测样品只需加10 μl，而ELISA方法只能1个孔测1种蛋白，所以要测两种蛋白就要用20 μl的样品。如果待测物再增多的话，基于SCCBs微列阵方法就会节省非常可观的待测样品。在检测高通量方面，传统的ELISA方法是单一检测的，而本研究中的新方法有报道称可以同时检测上百种待测样品。由于此技术是在1个试管内检测多种标记物，使其检测过程大大简化，效率大大提高。

基于SCCBs的多元检测技术与传统的ELISA方法分别对人胶质瘤细胞蛋白提取物中Bcl-2蛋白、p21蛋白的检测结果进行比对，显示两种方法检测结果具有较高的一致性。此外，较之ELISA法，基于SCCBs的多元检测方法可明显降低样品量，并可以在同一反应体系内完成多种肿瘤标记物的检测，极大地简化了免疫检测过程。由此可见，基于SCCBs编码载体的多元检测技术在基因研究、药物筛选、临床诊断等方面具有广泛的应用前景。在本研究中，一种新型的多元检测方法被应用于肿瘤标记物的检测，这种方法就是悬浮微列阵。SCCBs作为这种微列阵的载体，其表面是纳米粒子，这样可以大大减小空间位阻，提高反应动力学。因此，光子悬浮阵列特别适合检测疾病诊断标记物，值得进一步完善和探索。

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