TLR4／NF-κB在人结肠癌细胞SW620中的表达及CRX-526的抑制作用＊

黄宏耀 刘方方 张秋莹 刘国政 钱进

众所周知，Toll样受体（Toll-like Receptor，TLRs）是重要的细胞表面受体家族，参与机体对外源性生物的识别和免疫应答，且对肿瘤的发生、浸润和转移发挥关键作用。研究［1，2］表明，TLRs可通过识别病原相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Pattern，PAMPs）及某些内源性配体，引发信号传导而导致炎症介质释放，是天然免疫防御和获得性免疫系统的重要桥梁。TLR4是最早发现的TLRs家族成员之一，表达于多种细胞表面，在固有免疫中发挥着重要作用［3］。TLR4通过识别PAMPs，经过髓样分化蛋白分子（Myeloid Differentiation Factor 88，MyD88）依赖性信号传导分子激活核转录因子-κB（NF-κB）［4］，使之与抑制蛋白IκBα（IΚB）解离，进入到细胞核内启动多种基因的转录，使细胞释放大量炎症相关因子，造成组织损害［5］。

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，死亡率高，且发病率逐年上升。研究结肠癌发生、发展的分子机制及其潜在的治疗靶点和药物，具有重要的意义。因此，本研究利用脂多糖（LPS）刺激人结肠癌SW620细胞，观察TLR4／NF-κB 通路蛋白在受LPS刺激的肿瘤细胞中的表达变化；并通过裸鼠移植瘤试验，探讨TLR4拮抗剂CRX-526对结肠癌的治疗作用。

1 资料与方法

1.1 主要实验材料和试剂

人结肠癌SW620、LPS（E.coli O111：B4）、CRX-526，Trizol Reagent（美国Invitrogen 公司）；反转录试剂盒（日本Toyobo公司）；荧光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（美国ABI公司）；NF-κB（p65）抗体（美国Ebioscience公司）；Super-Signal ECL kit（美国Pierce公司）；蛋白提取试剂盒（中国碧云天生物Beyotime 公司）；IL-6、IL-8 ELISA 检测试剂盒（上海研谨生物科技有限公司）；实验动物为BALB／c-nu无胸腺裸鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，28日龄，雄性。

下述引物均由上海英俊公司合成。

TLR4引物上游序列：5’-AGC CAC CTC TCT ACC TTA ATA TTG A-3’，下游序列：3’-CCG AGT GTT AGA ATA GGT TAG AAA G-5’；NFκB（p65）DH 引物上游序列：5’-AGC CAC CTC TCT ACC TTA ATA TTG A-3’，下游序列：3’-CCG AGT GTT AGA ATA GGT TAG AAA G-5’；GAPDH 18S内参上游引物序列：5’-CCG AGA AGT TTC AGC ACA TCC-3’，下游序列：3’-TGG CAG TGA TAG CGA AGG CT-5’。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和处理：培养原代SW620细胞长至80%融合时，用含0.01%EDTA 的0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×103／ml，于37℃，5%CO2培养过夜，D-PBS洗涤两次后，LPS刺激组加入含10μg／L LPS 的RPMI 1640培养基，无刺激组加入不含LPS 的RPMI 1640培养基，再培养6h后收获细胞进行后续分析。

1.2.2 Real-time PCR 检测mRNA 表达：将上述两组再培养细胞分别按照Trizol试剂说明书提取TLR4和NF-κB（p65）总RNA，去除基因组DNA，然后根据反转录试剂盒说明书将总RNA 逆转录成cDNA，反转录体系为20μl。PCR 体系中依次加入cDNA 模板、上下游引物各900nmol／L，SYBR Green PCR Master mix 12.5μl至EP管中，补水至总体积25μl。每个检测样本设置3个平行孔，取平均值作为该样本拷贝数值评价其mRNA 表达水平。PCR 程序为：95℃变性5min，94℃、60℃、72℃各20s，45个循环。

1.2.3 Western Blotting 检测TLR4和NF-κB（p65）蛋白表达：按照蛋白提取试剂盒说明书提取1.2.1两组再培养细胞，蛋白变性后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳电压200V。电泳完毕后进行转膜，制作滤纸-凝胶-膜“三明治”，极恒流300mA 转移70min，于加样槽中加入相应的一抗1ml（1∶300），室温下于摇床孵育，用含吐温20的磷酸缓冲盐水洗涤10min，每个加样槽中加入二抗1ml，室温下于摇床孵育1h，ECL 底物化学发光，暗室曝光5～30s，照相。电泳结果采用Gelpro 3.2凝胶光密度分析软件处理，以样本平均光密度值（IOD）与内参GAPDH 的IOD 值之比表示TLR4和NF-κB（p65）蛋白相对表达量。

1.2.4 ELISA 检测IL-6和IL-8：按照说明书梯度稀释标准品及待测样本的培养上清，37℃温育30min。洗涤液洗涤6次，拍干后加入酶标试剂50μl，37℃温育30min。洗涤液洗涤6次后，每孔分别加入显色剂A 和B 各50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。每孔加终止液50μl，450nm 波长依序测量各孔吸光度（OD 值），并从标准曲线上获取IL-6和IL-8含量（pg／ml）。

1.2.5 裸鼠成瘤及CRX-526抑制试验：将试验用裸鼠随机分成抑制组和非抑制组，每组20只，均于前肢上段皮下注射LPS刺激培养（1×106个）的SW620细胞。各鼠于SPF级实验室饲养，自由饮食，观察其活动程度及双目是否有神。4周后抑制组用50μg TLR4拮抗剂CRX-526每日对瘤体进行多点注射1次，连续注射5天［6，7］。非抑制组平行注射等量生理盐水，余与抑制组同样处理。4周后两组裸鼠生长良好，无死亡。麻醉处死裸鼠并摘除肿瘤，测量肿瘤体积后切取部分肿瘤组织，匀浆后分成两份，一份按1.2.2方法进行Real-time PCR 检测TLR4和NF-κB（p65）mRNA，另一份按1.2.3方法进行Western Blotting分析TLR4和NF-κB（p65）蛋白表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。各组数据用均数±标准差（±s）表示，采用两配对样本t检验和两独立样本t检验进行各组比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 刺激培养SW620细胞的TLR4和NFκB（p65）mRNA 和蛋白表达

结果显示，LPS 刺激组TLR4和NF-κB（p65）mRNA 的拷贝数明显高于无刺激组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；LPS 刺激组TLR4和NF-κB（p65）蛋白相对表达量较无刺激组显著上升，见表1、图1。

2.2 LPS刺激培养SW620细胞的IL-6和IL-8水平

结果显示LPS抑制组IL-6和IL-8水平较无刺激组明显上调，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组培养SW620细胞TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷贝数和IL-6和IL-8表达水平（±s，n均=3）

表1 两组培养SW620细胞TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷贝数和IL-6和IL-8表达水平（±s，n均=3）

注：与无刺激组比较，1）P＜0.05

2.3 CRX-526对移植瘤生长和TLR4／NF-κB（p65）表达的抑制作用

2.3.1 CRX-526抑制移植瘤生长：裸鼠皮下注射肿瘤细胞后，第3天即可见肿瘤生长，及至第4周末，且边界清淅，挤压可活动。两组各有14只裸鼠成瘤，无鼠死亡，另12只未成瘤。注射CRX-5264周后，抑制组肿瘤体积分别明显小于非抑制组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2。

2.3.2 CRX-526抑制TLR4和NF-κB（p65）mR-NA 和蛋白表达：抑制组TLR4和NF-κB（p65）mRNA 的拷贝数显著低于非抑制组（P均＜0.05）。抑制组TLR4和NF-κB（p65）蛋白相对表达量明显低于非抑制组（P＜0.05）。见表2、图3。

表2 两组裸鼠肿瘤体积和TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷贝数比较（±s，n均=14）

表2 两组裸鼠肿瘤体积和TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷贝数比较（±s，n均=14）

注：与非抑制组比较，1）P＜0.05

图1 LPS对SW620细胞TLR4、NF-κB（p65）蛋白表达的影响

图3 TLR4拮抗剂CRX-526对移植瘤TLR4、NF-κB（p65）表达的影响

［本文图2见封2］

3 讨论

结肠癌是多种因素综合作用的结果，其病因与年龄、饮食、遗传、炎症等有关，特别是慢性结肠炎，其发展为结肠癌的几率较高［8］。TLR4不仅在炎症免疫反应中发挥关键作用，而且很可能与结肠癌的发生、发展密切相关［9］。在笔者的前期工作证实结肠癌组织标本的TLR4、NF-κB 及相关炎症因子的表达高于癌旁正常结肠组织［10，11］。本文进一步观察LPS 刺激培养结肠癌SW620细胞的TLR4和NF-κB（p65）mRNA 和蛋白的表达，并探讨TLR 抑制剂CRX-526对其的抑制作用。

本实验发现，LPS 刺激人结肠癌SW620细胞后，TLR4 mRNA 和蛋白水平均明显上调，NF-κB（p65）表达也明显增加，表明LPS 能激活TLR4／NF-κB信号通路。TLR4／NF-κB 信号通路被激活后，其下游的炎症相关因子IL-6和IL-8的表达水平随之升高，与TLR4、NF-κB（p65）的表达趋势一致，说明LPS刺激结肠癌SW620细胞后，通过激活TLR4／NF-κB信号通路能诱导IL-6和IL-8的表达。与Li等［12］研究表明的IL-6参与溃疡性结肠炎相关的结肠癌的发生，以及Lee等［13］发现肿瘤组织微环境中高表达IL-8及其受体CXCR2可促进结肠癌的发生、发展及转移的结果相同。

为了探讨TLR4是否可以作为结肠癌的治疗新靶点，本文利用SW620结肠癌细胞进行了裸鼠移植瘤试验，并用TLR4拮抗剂CRX-526对移植瘤进行多点注射。结果表明，CRX-526能有效抑制肿瘤生长，同时证实相关分子TLR4、NF-κB（p65）的表达均出现下调。提示TLR4／NF-κB 信号通路是结肠癌生长抑制的重要途径，可作为结肠癌治疗的新靶点，而且TLR4拮抗剂CRX-526对结肠癌具有潜在治疗价值。

总之，本资料对探讨炎症与肿瘤的相互关系以及TLR4／NF-κB信号通路作为结肠癌的治疗靶点获得初步结果，为今后的临床应用研究奠定了基础。

1 Heayat M，Takeda K，Rezaei N.Prophylactic and therapeutic implications of toll-like receptor ligands［J］.Med Res Rev，2012，32（2）：294～325.

2 Lee CC，Avalos AM，Ploegh HL.Accessory molecules for Tolllike receptors and their function［J］.Nat Rev Immunol，2012，12（3）：168～179.

3 Perros F，Lambrecht BN，Hammad H.TLR4signalling in pulmonary stromal cells is critical for inflammation and immunity in the airways［J］.Respir Res，2011，12（1）：125～132.

4 Stoll LL，Denning GM，Weintraub NL.Endotoxin，TLR4signaling and vascular inflammation：potential therapeutic targets in cardiovascular disease［J］.Curr Pharm Des，2006，12（32）：4229～4245.

5 Gimore TD，Wolenski FS.NF-kappa B：where did it come from and why？［J］.Immunol Rev，2012，246（1）：14～35.

6 Tone F.Bathen，Kristin.Omega-3fatty acids suppress growth of SW620human colon cancer xenografts in nude mice［J］.Anticancer Resarch，2008，28：3717～3724.

7 Fort MM，Mozaffarian A，Stöver AG.A synthetic TLR4antagonist has anti-inflammatory effects in two murine models of inflammatory bowel disease［J］.J Immunol，2005，174（10）：6416～6123.

8 Li H，Xu H，SUN B.Lipopolysaccharide regulates MMP-9expression through TLR4／NF-κB signaling in human arterial smooth muscle cells［J］.Mol Med Report，2012，6（4）：774～778.

9 Zhou B，Zhou H，Ling S，et al.Activation of PAR2or／and TLR4promotes SW620cell proliferation and migration via phosphorylation of ERK1／2［J］.Oncol Rep，2011，25（2）：503～511.

10 黄宏耀，陈巍巍，刘方方，等.TLR4和NF-κB p65表达与结肠癌的关系［J］.中华检验医学杂志，2010，33（10）：953～957.

11 黄宏耀，陈巍巍，张秋莹，等.结肠癌组织中Toll样受体4基因表达［J］.微循环学杂志，2010，20（1）：65～66.

12 Li Y，Deuring J，Peppelenbosch MP，et al.IL-6-induced DNMT1activity mediates SOCS3promoter hypermethylation in ulcerative colitis-related colorectal cancer［J］.Carcinogenesis，2012，33（10）：1189～1196.

13 Lee YS，Choi I，Ning Y，et al.Interleukin-8and its receptor CXCR2in the tumour microenvironment promote colon cancer growth，progression and metastasis［J］.Br J Cancer，2012，106（11）：1833～1841.