清醒与麻醉状态经典型热射病大鼠模型比较

耿焱，付炜，刘亚楠，彭娜，雷玉梅，苏磊

根据劳力性因素的有无，热射病(heat stroke，HS)分为劳力型热射病(exertional HS，EHS)和经典型热射病(classic HS，CHS)[1-2]。CHS具有高发病率和病死率，由于发病机制尚不清楚，临床缺乏有效而特异性的治疗手段，尽管采取了积极的降温和相应的脏器支持等处理措施，其病死率仍居高不下[3-6]。动物模型尤其是小动物模型对研究CHS的发病机制非常重要。目前普遍接受的实验性动物HS诊断标准包括动脉血压下降[1-4]，因为血压测量困难，研究CHS的小动物模型以大鼠为主，而大鼠动脉血压观察的经典方法是麻醉状态下行股动脉插管监测，但这种方法扰乱了大鼠在高温环境下体温调节的行为和生理机制，存在较大的混淆因素，影响了大鼠实验性CHS的研究。我们利用无创大鼠血压监测系统，首次构建了清醒状态下的CHS大鼠模型，并对比了该模型与传统麻醉状态下CHS模型的异同，为进一步研究自然状态下大鼠CHS的发病机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要设备 模拟热气候动物舱(南方医科大学公共卫生与热带卫生学学院提供)，BW-NIBP型无创大鼠鼠尾动脉血压测量仪(上海软隆科技发展有限公司)，Powlalr 8sp生理记录仪(澳大利亚Adinstruments公司)。

1.2 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠32只，体重281～314g，于南方医院实验动物中心饲养2周左右，环境温度23℃，湿度55%±5%，12h昼/夜循环。实验大鼠随机分为4组，每组8只，分别为：常温清醒状态对照组(C-NC组)﹑常温麻醉状态左股动脉插管对照组(N-NC组)﹑高温清醒状态组(C-CHS组)﹑高温麻醉状态左股动脉插管组(N-CHS组)。C-NC组和C-CHS组大鼠在实验前接受2周无创血压测量适应性训练，频率为2次/d。1.3 有创血压测量 参照Hall等[4]和Yang等[7]的方法，于大鼠左股动脉插管接生理记录仪测量收缩压(SBP)。N-NC组和N-CHS组大鼠在实验前2h接受左侧股动脉插管处理，具体步骤为：大鼠以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于操作台；切开左侧腹股沟皮肤，分离约1cm股动脉，结扎远心端，向心脏方向插管并固定，连接三通管，以肝素盐水125U/ml封管；稳定10min后进行下一步实验。

1.4 无创血压测量及验证 采用大鼠鼠尾动脉血压测量仪测量SBP值，应用有创血压测量系统验证。方法：在实验过程中随机选取6个时间点，将N-NC组和N-CHS组大鼠连接无创大鼠鼠尾动脉血压测量仪，同时进行有创及无创SBP测量，对比两种测量系统在测量值上的差异。

1.5 核心体温测量方法 用生理记录仪的热电偶测量各组大鼠直肠温度(Tr)，以Tr代表核心体温。

1.6 热打击方法及监测指标 热打击前将高温舱预热到30℃，在热打击前20min(time –20)和10min(time –10)时点各测量核心体温和SBP一次。热打击的方法：将C-CHS组和N-CHS组大鼠置于预热至30℃的仿真热气候动物舱(time 0)，30min内将舱内温度升至39℃，湿度65%。N-CHS组大鼠连接Powlalr 8sp生理记录仪，直肠内放置热电偶，每隔10min记录SBP和Tr一次，根据大鼠意识状态不定时少量补充10%水合氯醛，维持麻醉状态。C-CHS组大鼠每10min连接一次无创血压测量系统和直肠热电偶，记录SBP和Tr，达到CHS诊断标准后将大鼠从气候舱取出。CHS诊断标准：核心体温≥42℃，动脉SBP从峰值开始下降[5]。实验期间，各组大鼠均禁食﹑水，C-NC组和N-NC组大鼠全程置于23℃环境中。

1.7 恢复期处理方法 热打击结束后即进入恢复期处理。N-NC组和N-CHS组大鼠结扎左侧股动脉，拔除插管，缝闭切口，停止使用水合氯醛。各组大鼠接受20min酒精擦浴全身降温治疗后，恢复进食﹑水，放回原饲养环境中继续观察3d。

1.8 热应激计算方法 参考Leon等[8]的方法，通过量化计算方法对比不同HS组大鼠热应激反应的异同。以热暴露前的核心体温和SBP为基线核心体温和SBP，成模时(SBP从峰值开始下降)的核心体温为最大核心体温，以到达最大核心体温的时间代表总热暴露时间。总热负荷(℃·min)=核心体温≥39℃的热暴露时间×(最大核心体温－39℃)。若核心体温为39℃，则已经与热打击环境温度相同，在该温度下大鼠已经无法通过辐射散热。以核心体温≥42℃作为重度热负荷的开始，重度热负荷(℃·min)=核心体温≥42℃的热暴露时间×(最大核心体温－42℃)。核心体温上升速率=(最大核心体温－基线核心体温)/总热暴露时间×100%。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包分析数据。计量资料以±s表示，在方差齐性基础上应用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较最大核心体温﹑总热暴露时间﹑总热负荷﹑重度热负荷和核心体温上升速率；应用Kaplan-Meier法进行生存分析，假设检验采用log-rank法进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 无创血压测量系统的验证 利用有创血压测量系统进行的验证结果显示，N-NC组大鼠两种测量方式获得的SBP测量值存在123.56mmHg差值，鼠尾动脉测量值低于股动脉测量值，但两者变化趋势一致；N-CHS组大鼠两种测量方式获得的测量值基本相同，考虑为高温条件下鼠尾动脉血流量增加，提高了鼠尾动脉SBP测量的准确性。鼠尾动脉的舒张压(diastolic blood pressure，DBP)测量值不稳定，且与股动脉测量值相比有较大出入。验证结果提示，无创鼠尾动脉血压测量系统用于CHS模型大鼠的SBP测量是可行的，但DBP测量值不稳定，不适用于平均动脉压的计算。因此，本实验参考Yang等[7]的方法，选用SBP从峰值开始下降作为热射病的诊断标准。

2.2 热应激体温及血压调节反应特征 如图1所示，热暴露期间N-CHS和C-CHS组大鼠表现为不同的热应激反应。随热暴露时间的延长，N-CHS组大鼠的核心体温呈线性增高，直至达到最大核心体温；C-CHS组大鼠在热暴露期间，核心体温呈三相式增高，表现为初始阶段核心体温快速上升，随后表现为类似于平台的缓升期，缓升期持续较长时间，此后再次进入快速增长期，直至达到最大核心体温(图1A)。N-CHS和C-CHS组大鼠在到达最大核心体温前，SBP变化模式与核心体温变化模式基本相同，在到达最大核心体温时，SBP从峰值开始下降(图1B)。热暴露各个时段，N-CHS和C-CHS组核心体温﹑SBP均与对应的对照组有显著差异(P＜0.05)。与C-NC组相比，N-NC组大鼠基线核心体温和SBP水平较低(P＜0.05)。

图1 清醒及麻醉状态CHS模型大鼠核心体温和SBP调节特征Fig.1 Core temperature and SBP response profiles in conscious and unconscious classic heat stroke rats

图2 C-CHS和N-CHS组大鼠热应激核心体温调节反应Fig.2 Quantitative analysis of the thermoregulatory responses of C-CHS and N-CHS rats

2.3 热应激体温调节反应定量分析 如图2所示，N-CHS和C-CHS组大鼠最大核心体温无显著差异(P＞0.05)，而N-CHS组大鼠核心体温上升速率显著快于C-CHS组大鼠(P＜0.05)，总热负荷和重度热负荷均显著少于C-CHS组大鼠(P＜0.05)。

2.4 生存分析 N-CHS组大鼠在结束热暴露后12h内全部死亡，C-CHS组大鼠有5只在热暴露后3d仍存活，生存分析显示N-CHS组大鼠生存时间显著短于C-CHS组大鼠(图3，P＜0.05)。

图3 N-CHS组和C-CHS组大鼠生存时间对比Fig.3 Time-survivor curve of N-CHS and C-CHS rats

3 讨 论

临床上有关CHS的诊断标准包括核心体温超过41℃，皮肤干热﹑潮红，同时伴神经系统功能障碍[9-10]。与临床工作不同的是实验中很难通过观察上述症状来诊断大鼠CHS。因此，目前在CHS大鼠模型的研究中，以核心体温超过41℃和SBP从峰值下降作为诊断实验性CHS的标准[7]。传统的大鼠SBP测量方法为麻醉状态下股动脉插管监测，基于这种有创血压测量系统建立的CHS大鼠模型存在着不可忽视的方法学上的混淆因素，包括：麻醉可抑制体温调节机制，影响热应激体温调节反应[11-12]；在啮齿动物，向身体的腹侧涂抹唾液是蒸发散热必不可少的机制，然而在麻醉的情况下，这种行为受到抑制；股动脉插管需要结扎一侧股动脉，结果导致心脏前负荷增加，以及同侧后肢的缺血性损害及坏死，对机体产生致命性影响。上述混淆因素扰乱了动物在高温环境下调节体温的正常行为和生理学机制，导致不自然的热应激反应，影响了对实验性大鼠CHS的研究[8]。

我们首次使用无创血压测量系统构建了清醒状态下的CHS大鼠模型。对比麻醉和清醒状态下CHS大鼠模型的热应激血压和体温调节反应，我们发现两者存在较大不同。清醒状态CHS大鼠体温调节呈现三相式模式，包括初始快速上升期﹑平台样缓升期和终末快速上升期，而麻醉状态下的CHS大鼠体温调节呈单相式线性增高。血压调节也有类似现象，只是到达最大核心体温时从峰值开始下降。进一步定量分析热应激下体温调节显示，尽管两种模型在最大核心体温上无显著差异，但对比清醒状态下的CHS大鼠，麻醉状态下CHS大鼠的核心体温上升速率显著加快，成模时间(总热暴露时间)显著缩短。三相式核心体温调节特征更接近大鼠的自然状态，表现为：热应激的初始阶段，由于环境温度大于核心体温，导致无法代偿的热负荷，出现核心体温陡然上升；上升到大于环境温度的水平后，清醒状态下的大鼠可以通过涂抹唾液和尿液等行为加强蒸发散热，从而将体内的热量有效散发到外界环境，减缓核心体温的上升，导致出现可辨识的平台样缓升期；缓升期后核心体温的第二次陡然上升直到最大核心体温，提示体温调节的破坏。受核心体温的影响，SBP的调节水平也呈现类似的三相式调节特征，直至达到最大核心体温，此时SBP从峰值下降。麻醉状态大鼠因为体温调节的生理行为受抑制，因此表现为单相式线性上升。值得注意的是，尽管热负荷定量分析显示，麻醉状态下CHS大鼠的总热负荷和严重热负荷均显著低于清醒状态下的CHS大鼠，但其预后更差，并且没有大鼠的生存时间超过12h。我们推测可能与股动脉结扎的副作用有关。以上结果表明，清醒状态CHS模型更接近大鼠的生理状态。

本研究结果证实，相比传统的麻醉状态CHS大鼠模型，基于无创血压测量系统的清醒状态CHS大鼠模型更适用于实验性大鼠CHS的研究。对于清醒状态CHS大鼠模型的进一步研究，可以促进对CHS发病机制的理解。

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