HPLC法测定秦岭柴胡及其不同提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d

卫 昊， 刘 清， 卫伟光， 崔春利， 张 倩

(1.陕西中医学院药学院，陕西咸阳 712046;2.陕西省西安植物园，陕西西安 710061)

秦岭柴胡Bupleurum longicauleWall.ex DC.var.giraldiiWolff.又称金柴胡 (太白)，系伞形科柴胡属多年生草本植物，与2010年版《中国药典》一部中收载的柴胡同属不同种，属于高山珍稀药用植物。主产秦岭太白山、光头山及佛坪等地，在甘肃天水、武山，青海的民和、玉树和山西也均有分布。味苦，性微寒，归肝经。现代药理研究表明秦岭柴胡有保肝，解热，抗菌，抗病毒，消炎，镇咳，预防消化道溃疡等作用［1-2］。柴胡属植物化学成分有三萜皂苷、黄酮类、植物甾醇、香豆精类、木脂类及少量挥发油［3-4］，其中皂苷类成分中含有量较高的有柴胡皂苷a、c、d。药理实验研究表明皂苷a、d具有明显的药理活性［5］，目前柴胡皂苷a、d已成为检验药用柴胡质量的标准［6］。因此对柴胡皂苷a、d进行定量分析，可作为评价秦岭柴胡生药质量的重要依据。然而，现有文献中，关于HPLC法测定柴胡皂苷a的报道较多，但未见有对秦岭柴胡中柴胡皂苷a、d同时进行定量测定的报道。故本研究采用HPLC法，选择合适的色谱条件同时对生长在东、西太白山上的秦岭柴胡中柴胡皂苷a、d进行定量测定研究，以期为今后秦岭柴胡的开发和应用提供一定的实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters 2996DAD，Empower色谱工作站，BT25s(十万分之一)电子天平 (北京赛多利斯仪器有限公司)，LD—4型高速中药粉碎机 (浙江省温岭市大海药材器械厂)，CQ—250型超声清洗器 (上海超声仪器厂)。

1.2 试药 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品 (中国药品生物制品检定所，供定量测定用，批号依次为:110777-200507、110778-200505)。秦岭柴胡:1号药材样品采自东太白山 (陕西眉县)海拔3 400～3 500 m处;2号药材样品采自西太白山(陕西太白县)海拔3 400 m左右处。均经陕西中医学院王继涛高级实验师鉴定为伞形科植物秦岭柴胡Bupleurum longicauleWall.ex DC.var.giraldiiWolff的全草。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水 (25∶75);体积流量1.0 mL/min;检测波长210 nm;柱温29℃;进样量10 μL。

2.2 柴胡皂苷a、d对照品溶液的制备 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 1.075 mg、含柴胡皂苷d 0.072 mg的对照品溶液，摇匀，即得。

2.3 秦岭柴胡不同溶剂提取液的制备 取秦岭柴胡1号、2号样品各约250 g，精密称定，分别加水煎煮2次，每次2 h，过滤，合并滤液，加热浓缩，分别定容于250 mL量瓶中;另取秦岭柴胡1号、2号样品各约250 g，精密称定，分别以65%乙醇及95%乙醇为溶剂加热回流2次，过滤，合并滤液，回收乙醇至无醇味，浓缩定容至250mL量瓶中。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 秦岭柴胡药材供试品溶液的制备 取秦岭柴胡1号、2号样品粉末 (过四号筛)各约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水温超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得，临用前过0.45 μm滤膜，作为进样溶液［7］。

2.4.2 秦岭柴胡不同溶剂提取供试品溶液的制备精密吸取2.3项下秦岭柴胡1号、2号样品水提取浓缩液5 mL，65%乙醇提取浓缩液2 mL，95%乙醇提取浓缩液4 mL，置于分液漏斗中，以乙醚脱脂3次，每次20 mL，并以水饱和正丁醇萃取3次，每次30 mL，再以正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30 mL，将得到的上层液在蒸发皿中水浴挥干正丁醇，再以甲醇溶解并将经上述处理的水提取物定容至2 mL量瓶，65%乙醇、95%乙醇提取物均定容至5 mL量瓶，摇匀，均以0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液［8-11］。

2.5 系统适用性试验 精密吸取柴胡皂苷a对照品溶液、柴胡皂苷d对照品溶液、东太白秦岭柴胡65%乙醇提取液制得的供试品溶液，注入HPLC色谱仪，色谱图见图1，在选定的色谱条件下柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的理论塔板数均不少于6 000，与其他峰的分离度均大于1.5。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线的制备 精密吸取2.2项下的柴胡皂苷a对照品溶液和柴胡皂苷d对照品溶液各2、4、8、12、16、20、25 μL注入高效液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 标准曲线Tab.1 Standard curve

2.6.2 精密度试验 精密吸取1.075 mg/mL的柴胡皂苷a对照品溶液和0.072 mg/mL的柴胡皂苷d对照品溶液，按同样色谱条件进行HPLC分析，各连续进样5次，每次10 μL，计算峰面积，RSD分别为1.6%和0.62%，表明本法精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 精密吸取秦岭柴胡1号样品65%乙醇提取物的供试品10 μL，在0、4、8 h分别进样分析，记录色谱峰面积，结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面积的RSD值分别为0.08%和1.58%。结果表明，供试品在本实验条件下稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取秦岭柴胡药材1号样品粉末5份，每份约2 g，按2.3项和2.4.2项65%乙醇回流提取方法制备，并进样分析，记录色谱峰面积，结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面积的RSD值分别为1.59%和1.00%。结果表明，本方法重复性较好。

2.6.5 加样回收率试验 取柴胡皂苷a(1.075 mg/mL)对照品溶液5.3 mL、柴胡皂苷d(0.072 mg/mL)对照品溶液7 mL加入秦岭柴胡药材1号样品粉末中，按2.3项和2.4.2项65%乙醇回流提取方法制备的供试品溶液分别于10 mL量瓶，混合均匀，定容至刻度，然后进行HPLC分析，结果柴胡皂苷 a的平均回收率为98.31%，RSD为1.04%;柴胡皂苷d的平均回收率为97.00%，RSD为1.12%。结果见表2和表3。

表2 柴胡皂苷a回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests of saikosaponin a

表3 柴胡皂苷d回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests of saikosaponin d

2.7 东西太白秦岭柴胡比较 分别取秦岭柴胡1号、2号样品药材，按2.3项下方法制备 (2号样品即西太白秦岭柴胡定容于2 mL量瓶中)，精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，计算柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的量，结果见表4和5。

表4 药材供试品溶液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d测定结果Tab.4 Determination results of saikosaponin a and saikosaponin d in samples of different extracts

表5 不同提取部位柴胡皂苷a和柴胡皂苷d测定结果Tab.5 Determination results of saikosaponin a and saikosaponin d in samples of different extracted parts

3 讨论

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d结构中的环氧结构在高温或酸性条件下易开环，转化成柴胡皂苷b1和b2，因此提取条件需要加以注意，最好在碱性条件下低温提取，因此制定了2.4.1项下的药材供试品溶液制备方案。而在工业生产中，提取溶媒通常为水和乙醇，所以本实验在供试样品制备中采用2.3项下的提取方案。柴胡皂苷结构见图2。

一般采用50%～70%乙醇提取中等极性的成分，85%～95%乙醇提极性较小成分，本实验采用水、65%乙醇和95%乙醇来提取药材，是为了后续进一步进行其药效学评价和量效关系而设计的提取方案。从表5中可以看出，65%乙醇提取物中柴胡皂苷a和d的含有量高于水和95%乙醇提取物中的柴胡皂苷a和d。由于柴胡皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度较好［12］，因此本实验将正丁醇作为萃取柴胡皂苷的溶剂。

图2 柴胡皂苷结构Fig.2 Structures of saikosaponins

在2.7项下进行西太白秦岭柴胡中柴胡皂苷d测定时，由于在拟定的供试品制备条件下峰面积太小，低于线性范围的下限，因此，将其最终定容体积确定为2 mL，使得测定的峰面积处于线性范围内，保证了测定结果的准确性。

本实验采用HPLC法对不同生长区域的秦岭柴胡及其不同溶剂提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d进行了测定，其分析方法简便可行。但柴胡皂苷d峰面积小，含有量低，其中，以秦岭柴胡2号样品65%乙醇提取物，秦岭柴胡1号样品95%乙醇提取物中柴胡皂苷d峰型最小，经计算S/N(信噪比)小于10，峰面积不可靠，不能有效计算其量。表5结果表明:不同溶剂系统的提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷a、d之和的差异较大，不能单用柴胡皂苷a的含有量来评价柴胡的质量，最好两者兼顾。另外，本实验通过对两种产地的秦岭柴胡不同提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的测定，也为下一步开展药理作用中量效关系研究提供了一定的实验依据。

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