RP-HPLC法同时测定淫桂通便颗粒中6种成分

王 蕾， 谈瑄忠， 毛春芹， 陆兔林， 王会娟， 胡颖菲

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046;2.南京市中医院，江苏南京 210001)

淫桂通便颗粒由肉桂、淫羊藿、厚朴、葛根、薤白、茯苓共六味饮片组成，具有温补脾肾、润肠通便之功效，用于治疗脾肾阳虚型便秘。本方为南京市中医院院内经验方，已在临床使用多年，对脾肾阳虚便秘具有治疗作用，且能温阳活血标本兼治。肉桂、淫羊藿是方中重要药物，肉桂具有补火助阳，引火归源，散寒止痛等作用，其有效成分为肉桂醛［1－2］;淫羊藿有补肾阳的作用，其有效成分是淫羊藿苷［3－5］。目前采用薄层鉴别法对其中几味药进行了质量控制，而且现行采用HPLC法对制剂的质量控制大多只测一种成分，不能全面反应控制复方质量［6－7］，为了更好控制本品质量，本研究采用HPLC法同时定量测定方中葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚与厚朴酚，效果理想，达到了全面控制该制剂质量的目的，可为临床安全用药提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器);Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(淮阴汉邦科技有限公司);紫外分析仪WD-9403C型 (北京市六一仪器厂);水浴锅 (巩义市英峪予华仪器厂);FA1104型万分之一电子分析天平 (上海天平仪器厂);KQ-500E型医用超声清洗器 (昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药 葛根素对照品(批号110752-200511)、淫羊藿苷对照品 (批号 110737-200312)、肉桂酸对照品 (批号110786-200503)、肉桂醛对照品 (批号110795-201007)、和厚朴酚(批号 110730-201011)、厚朴酚 (批号 110729-200411)均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，甲醇、磷酸为分析纯。淫桂通便颗粒为医院自制 (批号为120322、120325、120329，规格为:10g/袋)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);柱温35℃;流动相为乙腈 －0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;检测波长290 nm。对照品色谱图、样品色谱图及阴性样品色谱图见图1。

表1 梯度洗脱时间顺序Tab.1 Mobile phase in gradient elution mode

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合对照品贮备液的制备 分别精密称取葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为每1 mL含葛根素0.039 0 mg、淫羊藿苷0.217 5 mg、肉桂酸0.184 2 mg、肉桂醛0.012 5 mg、和厚朴酚0.556 9 mg以及厚朴酚0.446 2 mg的对照品贮备溶液。精密量取上述对照品溶液适量置5 mL量瓶中，甲醇定容，混匀，制成每1 mL含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚分别为 7.8、43.5、36.84、2.5、55.69、44.62 μg 的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备 取供试品约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷至室温，以甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别称取除葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴以外的其余药味，按照淫桂通便颗粒的制备工艺，制备不含葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴的阴性样品。按2.3项下方法制成缺葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴的阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察 精密量取混合对照品1 mL，稀释1倍，分别进样4、6、8、10、20 μL，测定峰面积。以峰面积对质量浓度进行线性回归，得回归方程分别为:葛根素Y=57.66X+4.591 2，r=0.999 9;淫羊藿苷Y=11.797X－4.503 1，r=0.999 6;肉桂酸Y=71.527X－24.91，r=0.999 7;肉桂醛Y=2 701.2X－40.667，r=0.999 8;和厚朴酚Y=19.014X－5.793 7，r=0.999 7;厚朴酚Y=22.207X+3.905 2，r=0.999 7。结果表明，葛根素在1.56～7.80 μg、淫羊藿苷在8.70～43.50 μg、肉桂酸在7.37～36.84 μg、肉桂醛在 0.5～2.5 μg、和厚朴酚 8.92～44.62 μg、厚朴酚在11.14 ～55.69 μg 范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取同一样品溶液10 μL，连续进样6次，记录各峰面积，并计算各RSD值。结果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚峰面积RSD分别为0.79%、0.97%、1.24%、0.01%、0.01%、1.21%，表明仪器精密度良好，符合定量测定要求。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液，于室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，结果表明所测6种成分在24 h内稳定。葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚峰面积的 RSD分别为 2.60%、0.41%、2.89%、2.12%、2.91%、2.64%。

2.8 重复性试验 取同一批供试品，按2.3项下方法，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱进样分析，葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚质量分数分别为0.548 3、0.622 4、0.414 7、0.023 7、0.238 2、0.534 3 mg/g;RSD 分别为2.94%、1.83%、2.85%、2.54%、2.26%、1.93%，表明该方法重复性良好。

2.9 准确度试验 分别精密称取6种对照品适量，置同一量瓶中，配置成分别含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚0.242 0、0.339 8、0.275 3、0.010 1、0.213 0、0.220 3 mg/mL的混合对照品溶液，备用。精密称取已测定的样品9份，每份约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样记录色谱峰，计算各回收率。结果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚的平均加样回收率依次为 97.20%、98.78%、97.48%、97.39%、98.81%、98.40%，RSD分别为2.15%、0.79%、1.71%、1.47%、0.82%、0.91%。

2.10 样品测定 取各批淫桂通便颗粒样品(120322、120325、120329)，精密称取约2 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，按上述色谱条件进样分析，记录色谱峰，根据外标两点法计算样品中6种成分的含量，结果见表2。

表2 3批淫桂通便颗粒样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of the three batches of samples in Yingui Tongbian Granules(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 对检测波长选择时，由于淫桂通便颗粒成分复杂，其主要有效成分的紫外吸收差异很大，试验中对混合对照品进行吸收光谱扫描，结果表明在260 nm以下淫羊藿苷、肉桂醛等被测灵敏度大大降低，和厚朴酚、厚朴酚基本检测不出;在290 nm处有被测各种成分均能出峰，为了使各组分在同一波长下都能有较好吸收，达到吸收强、干扰小的目的，故选择290 nm作为检测波长。

3.2 提取方法的选择 根据文献报道［8-9］，本实验分别考察了提取溶剂甲醇和乙醇，结果表明甲醇提取率比乙醇提取率高，甲醇提取的供试品进入液相杂质干扰少，所以选择甲醇作为提取溶剂;同时考察了提取方式［10］(冷浸提取、超声提取和回流提取)、提取时间 (20、30、40 min)对提取结果的影响，结果表明超声提取与回流提取对提取率没有显著差异;超声提取20、30、40 min对提取率没有显著差异。综合考虑提取时间、成本、提取率，选择甲醇超声提取20 min。

3.3 流动相的选择 参考文献［11-12］比较了多种流动相系统，包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液，结果表明采用乙腈-磷酸水溶液，基线平稳，大多数化合物具有更高的灵敏度，且肉桂酸的峰型较好，各峰均没有拖尾，各峰间的分离度均达到1.5以上，故选择流动相为乙腈－0.1%磷酸水梯度洗脱。

［1］朱自平，张明发，沈雅琴，等.肉桂的温中止痛药理研究［J］.中国中药杂志，1993，18(9):553-557.

［2］邱 琴，崔兆杰，韦栋梁，等.肉桂挥发油化学成分的研究［J］.上海中医药大学学报，2003，17(3):49-51.

［3］张华峰，杨晓华.淫羊藿的生物活性成分及其开发策略研究［J］.中草药，2010，41(2):329-332.

［4］王昌林，李 昱，王粤新.淫羊藿及其有效成分的药理研究概况［J］.中国中药杂志，1998，23(3):183-184.

［5］洪 玉，马惠荣.淫羊藿的药理研究［J］.陕西中医学院学报，2010，35(5):91-92.

［6］王翰华，沈岳光，陆元勋.浅析中药质量标准中建立多指标含量测定体系［J］.中医药导报，2010，16(10):96.

［7］辛敏通，李 铮，郭洪祝，等.对中药质量标准研究现状和发展的思考［J］.中国新药杂志，2012，21(7):710-713.

［8］宫 鹏，陈 镇.筋骨胶囊质量标准研究［J］.安徽医药，2010，13(7):92-94.

［9］索菲娅，陈世忠.健胃整肠丸质量标准的研究［J］.中成药，2002，24(8):24-28.

［10］夏爱军，黄河舟，高 岗，等.HPLC法同时测定淫羊藿药材中的5个黄酮类成分［J］.药物分析杂志，2009，27(4):285.

［11］朱小红，林 芳，宋 辉，等.小儿泻痢片质量标准研究［J］.药物分析杂志，2011，31(7):1318-1319.

［12］王祥红，谢培山，田润涛，等.复方中成药保济丸的HPLC-DAD指纹图谱研究［J］.中国中药杂志，2007，32(17):1748.