毛细管电泳法测定欧亚旋覆花中芦丁、山柰酚和绿原酸

冯海燕， 李向军， 雷 霓， 张 林

(1.石家庄学院化工学院，河北石家庄 050035;2.中国科学院大学化学与化学工程学院，北京 100049)

欧亚旋覆花为菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花Inula britannicaL.的干燥头状花序，是一种传统中药，具有降气止呕，消痰行水之功效，主治咳嗽消痰、胁下胀满、大腹水肿、泄散风寒等症［1-2］。研究表明，欧亚旋覆花黄酮具有良好的抗氧化活性［3-6］，是其发挥药效的主要物质基础;绿原酸因具有抗菌消炎、增强机体免疫的作用［7］，也为欧亚旋覆花的一种有效成分。

关于欧亚旋覆花中黄酮类成分和绿原酸的检测，主要采用 HPLC法［7-9］。高效毛细管电泳(HPCE)以其高效、快速、低耗的特点，已广泛应用于中药活性成分的检测［10］。本实验采用HPCE法，对欧亚旋覆花中两种黄酮类成分 (芦丁和山柰酚)进行了测定，并同时对绿原酸的量进行分析。

1 仪器与试剂

CL1030高效毛细管电泳仪 (北京彩陆科学仪器有限公司);熔融石英毛细管 (50 cm ×50 μm，有效长度为42 cm，河北永年光导纤维厂);DELTA 320 pH计［梅特勒—托利多仪器 (上海)有限公司］;KQ—250DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);S2—93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);RE—52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

芦丁、山柰酚、绿原酸对照品均购于中国药品生物制品检定所 (批号分别为:100080-200707，110861-200808和110753-200413);欧亚旋覆花购于河北安国、山西、河南，经本学院生药教研室岳红坤副教授鉴定。其他化学试剂皆为分析纯，实验用水为重蒸水。

2 实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液 精密称取芦丁、山柰酚、绿原酸适量，分别加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得质量浓度为3.2 mg/mL芦丁，2.0 mg/mL山柰酚和2.1 mg/mL绿原酸贮备液，冰箱中保存。使用前用甲醇适当稀释。

2.1.2 供试品溶液 取欧亚旋覆花1.0 g，精密称定，加入200 mL水，在功率200 W，提取温度60℃的条件下超声提取45 min，滤过，定容于250 mL量瓶中。吸取提取液50 mL，减压浓缩，至终体积为25 mL，即得供试品溶液。

2.2 电泳条件 运行缓冲液为10 mmol/L硼砂溶液 (pH 9.5);重力进样10 cm，13 s;分离电压23 kV;检测波长254 nm。毛细管柱在第一次使用前依次用甲醇、重蒸水、1 mol/L氢氧化钠溶液、重蒸水和运行缓冲液各冲洗10 min，每次电泳后以重蒸水、0.1 mol/L氢氧化钠溶液、重蒸水和运行缓冲溶液依次冲洗2、3、4、5 min。样品溶液和缓冲溶液使用前需经0.22 μm的滤膜过滤并超声脱气。

3 结果与讨论

3.1 电泳条件优化

3.1.1 缓冲液组成和浓度 芦丁和绿原酸含有邻二羟基，山柰酚含有间二羟基，均可与硼砂复合成带电粒子［11］，从而改善分离效果，故实验以硼砂体系作为缓冲溶液。预实验发现，芦丁和山柰酚的出峰时间比较接近，而与绿原酸的出峰时间相差较远，故实验主要考察硼砂浓度对芦丁和山柰酚迁移时间的影响。硼砂浓度较低时，山柰酚与芦丁间的分离度随硼砂浓度的改变无明显变化 (图1A);当浓度高于10 mmol/L时，随硼砂浓度的增加两者的分离度变差，当硼砂浓度为20 mmol/L时，两谱峰完全重叠;再增加硼砂的浓度，芦丁和山柰酚的出峰顺序发生翻转，两者间的分离效果逐渐变好。考虑到硼砂浓度较高，会引起工作电流的升高，焦耳热的增加及出峰时间的延长，实验选择10 mmol/L的硼砂缓冲溶液。

3.1.2 缓冲液pH pH能影响zeta电势、电渗流(EOF)和分析物的带电情况，进而影响分析物的迁移时间和分离效果。当pH为9.0时，芦丁和山柰酚两组分的电泳谱峰完全重叠;继续升高缓冲液pH，二者间的分离程度加大。当缓冲液pH为9.5时，既能保证芦丁和山柰酚间的良好分离，又能使整个分析时间较短 (图1B)，故实验选择pH 9.5的硼砂缓冲溶液。

图1 缓冲液浓度 (A)和pH(B)对出峰时间的影响Fig.1 Effects of the concentration(A)and pH(B)of the buffer solution on the migration time

3.1.3 工作电压 试验对工作电压从14～29 kV每隔3个单位进行考察，发现随工作电压的升高，迁移时间缩短，但分离度变差。在工作电压为23 kV时，3组分可得到较好分离，且迁移时间及峰高适中，故实验选择23 kV为工作电压。

3.1.4 进样时间 固定缓冲液浓度、pH及分离电压，在进样高度10 cm的前提下，调节进样时间依次为3、7、9、11、13和15 s，考察进样时间对分析物峰高的影响。结果发现:随进样时间的增加，峰高逐渐增大，但在13 s以后峰高变化不再明显，且峰形加宽，出现拖尾现象，实验选择13 s为最佳进样时间。

3.2 提取条件优化

3.2.1 提取方法 选择超声波提取法提取欧亚旋覆花中的活性成分，考察了不同提取溶剂 (水、50%乙醇、无水乙醇)对3种活性成分提取率的影响。结果表明，以水为溶剂3种成分总含有量最高，且安全无毒，操作方便，故实验以水做提取溶剂。

3.2.2 提取条件 选择固液比、提取温度、提取时间3个因素，每个因素选择3个水平，设定因素水平表，进行正交实验，确定2.1项下提取条件。

3.3 线性方程和检出限 取对照品贮备溶液，逐级稀释成一系列质量浓度的对照品溶液，在优化的条件下进样 (谱图见图2A)。以芦丁、山柰酚、绿原酸的质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰高Y为纵坐标，得到线性回归方程，按信噪比为3计算最低检出限，实验结果参见表1。

图2 混合对照品 (A)和样品 (B)的电泳图Fig.2 Electropherograms of mixed reference substances(A)and the samples(B)

表1 回归方程和检出限Tab.1 Regression equations and detection limits

3.4 精密度试验 按试验条件以质量浓度均为75 μg/mL的混合标准溶液考察所建实验方法的重现性，连续进样5次，芦丁、山柰酚、绿原酸迁移时间的RSD分别为0.41%、0.66%和0.34%，峰高的RSD分别为2.01%、1.75%、1.45%。

3.5 稳定性试验 取河北产欧亚旋覆花供试品溶液，按2.2项下电泳条件分别在0、0.5、1、2、4、6 h测定芦丁、山柰酚、绿原酸峰高，其RSD分别为1.82%、1.23%和1.69%，说明常温下6 h内，供试品溶液保持稳定。

3.6 重复性试验 取同一批欧亚旋覆花药材样品，平行制备供试品溶液5份，分别进行毛细管电泳分析。测得样品中芦丁、山柰酚和绿原酸的含有量，RSD分别为2.24%、1.94%和1.70%，说明该测定方法重复性较好。

3.7 回收率试验 精密称取已知含有量的样品粉末0.5 g，加入质量浓度分别为0.4、1.0、0.2 mg/mL的芦丁、山柰酚和绿原酸对照品溶液0.50、0.60和0.50 mL，按2.1项下提取、定容、测定，计算加样回收率和RSD，实验结果列于表2。

表2 回收试验结果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

3.8 样品测定 取不同产地的欧亚旋覆花药材样品，按2.1项下操作制备供试品溶液，按2.2项下电泳条件进样分析。采用外标法计算含有量，结果见表3，电泳图见图2B。不难看出，不同产地的欧亚旋覆花中芦丁、山柰酚、绿原酸的量有所不同，其中山西产欧亚旋覆花中3种成分的总量最高，这可能与药材的品种基因、生长环境和贮存条件等因素有关;3种来源的欧亚旋覆花中山柰酚的量普遍较高，明显高于另外两种成分，在0.92～1.73 mg/g之间，有可能是欧亚旋覆花的主要活性成分［9］，其分析方法的建立就显得尤为重要。

4 小结

毛细管电泳法测定欧亚旋覆花中芦丁、山柰酚和绿原酸具有快速 (＜6 min)、准确、微量的优点。实验结果表明，不同产地欧亚旋覆花药材中3种成分的量有所差异，山柰酚可能是欧亚旋覆花中主要的活性成分，测定其含有量对欧亚旋覆花的质量控制具有重要意义。本方法的建立为全面评价欧亚旋覆花及其相关药物的质量提供了一种简便可靠的分析方法。

表3 不同产地欧亚旋覆花中 3种分析物的测定结果(n=5)Tab.3 Contents of three constituents in Inula britannica L.from different habitats(n=5)

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:305.

［2］耿红梅，张俊英，张嫡群.欧亚旋覆花化学成分的研究［J］.中成药，2008，30(8):1188-1189.

［3］Kim S R，Park M J，Lee M K，et al.Flavonoids ofInula britannicaprotect cultured cortical cells from necrotic cell death induced by glutamate［J］.Free Radical Biol Med，2002，32(7):596-604.

［4］Zhang Hongbing，Wen Jinkun，Wang Yanyan，et al.Flavonoids fromInula britannicaL.inhibit injury-induced neointimal formation by suppressing oxidative-stress generation［J］.J Ethnopharmacol，2009，126(1):176-183.

［5］张红兵，韩 梅，温进坤.欧亚旋覆花总黄酮类提取物抑制内皮损伤诱导的血管氧化应激反应［J］.中国中药杂志，2009，34(5):615-619.

［6］Bai Naisheng，Zhou Zhu，Zhu Nanqun，et al.Antioxidative flavonoids from the flower ofInula britannica［J］.J Food Lipids，2005，12(2):141-149.

［7］耿红梅.高效液相色谱法测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量［J］.时珍国医国药，2009，20(1):201-202.

［8］Geng Hongmei，Zhang Diqun，Zha Jianpeng，et al.Simultaneous HPLC determination of five flavonoids inFlos Inulae［J］.Chromatographia，2007，66(3-4):271-275.

［9］耿红梅.RP-HPLC法同时测定欧亚旋覆花中4种黄酮的含量［J］.中国药房，2009，20(27):2122-2123.

［10］刘虎威.色谱和毛细管电泳在中药现代化过程中的作用［J］.色谱，2003，21(4):307-310.

［11］Luo Mina，Lu Huawei，Ma Huaqiao，et al.Separation and determination of flavonoids inLamiophlomis rotataby capillary electrophoresis using borate as electrolyte［J］.J Pharmaceut Biomed，2007，44(4):881-886.