吴茱萸提取物的透皮吸收促进剂的筛选

何嘉仑， 唐洪梅*， 涂 星， 李得堂， 丘振文

(1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405;2.广州中医药大学，广东广州 510405)

吴茱萸Evodia rutaecarpa为芸香科植物吴茱萸、石虎及疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实。吴茱萸碱(evodiamine)和吴茱萸次碱 (rutaeearpine)等吲哚喹啉类生物碱是其有效活性成分，药理学研究证明吴茱萸碱和吴茱萸次碱具有降压、心脏保护、松弛非血管平滑肌、抗血栓、抗过敏、抗肿瘤、减肥、调节体温、抗炎、镇痛等作用，涉及心血管系统、消化系统、免疫系统、神经系统等，外用对治疗咳嗽、口腔溃疡、小儿疱疹性咽峡炎、高血压等疾病具有良好的效果［1-3］。吴茱萸碱和吴茱萸次碱为难溶性化合物，几乎不溶于水和多数有机溶剂，口 困难［4］。全身给予吴茱萸碱和吴茱萸次碱 挥该类化合物镇痛作用的理想给药途径。而 用药物可直达病灶区，提高局部药物浓度 药物在全身循环或其它组织的分布，降低出 不良反应的风险［5］。因此局部施药为首选 径，局部施药的关键是药物的经皮渗透能力，经皮渗透能力可通过添加促渗剂来改善，促渗剂通过改变皮肤角质层脂质或蛋白间的相互作用提高药物的渗透量［6］。为更好研究吴茱萸提取物体外经皮渗透行为，本研究建立体外透皮吸收实验方法，考察不同促渗剂及其质量分数对吴茱萸贴剂体外经皮吸收的影响，以筛选最佳质的促渗剂及其最佳质量分数。

1 实验材料

TK—12A型透皮扩散试验仪，7 mL立式玻璃扩散池，接口面积2.92 cm2(上海锴凯科技贸易有限公司);KQ5200DE型数控超声清洗器 (江苏省昆山市超声仪器有限公司);Agilent HP1200型高效液相色谱仪;BP211D型电子分析天平;RE—2000型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。

吴茱萸购自岭南中药饮品有限公司，经鉴定符合《中国药典》要求;氮酮 (Azone，AR级，天津市北联精细化学品开发有限公司);油酸 (AR级，广州化学试剂厂);1，2-丙二醇 (汕头市光华化学品厂);

裸鼠，6～7周龄，体质量 (80±15)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物卫生许可证号为 SCXK(粤)2008-0020，粤监证字2008A002。

2 体外透皮吸收实验方法

2.1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱的体外分析方法建立

2.1.1 供试药液的配制

吴茱萸提取物的制备 精密称取吴茱萸300 g，加入5倍量95%乙醇提取超声2次，每次40 min，合并所得提取液，在50℃条件下减压浓缩至流浸膏，用95%乙醇定容至25 mL，置于棕色容量瓶中，得到吴茱萸提取物，于－20℃冰箱中保存备用 (经测定，每1 mL含吴茱萸碱250.086 7 μg，吴茱萸次碱62.213 3 μg)。

对照品溶液的制备 精密称取吴茱萸碱约0.6 mg、吴茱萸次碱约0.2 mg，加30%乙醇至70%生理盐水定容至每1 mL含吴茱萸碱60 μg、吴茱萸次碱20 μg的混合贮备液。

2.1.2 色谱条件［7］Phenomenex C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水 (49∶51);检测波长225 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温25℃。在此条件下，测得吴茱萸碱峰的保留时间约为12.69 min(1号峰)，吴茱萸次碱峰的保留时间约为14.73 min(2号峰)。理论塔板数按蛇床子素计应不小于3 000，最低检测限吴茱萸碱为0.5 μg/mL，吴茱萸次碱为0.20 μg/mL，见图1。

图1 吴茱萸HPLC图谱Fig.1 Evodia rutaecarpa extract HPLC chromatograms

2.1.3 标准曲线的制作 取对照品贮备液加30%乙醇至70%生理盐水溶液制成含吴茱萸碱质量浓度为1.25、2.5、7.5、15、37.5、60 μg/mL 和吴茱萸次碱0.20、0.67、1.34、6.7、12.8、20.1 μg/mL的系列标准溶液，按上述色谱条件每个样品重复进样3次，以吸收峰面积 (A)对质量浓度 (C)进行线性回归，得吴茱萸碱回归方程为A=36.341 3C－25.998 4，r=0.999 9;吴茱萸次碱回归方程为A=50.829 8C+5.084 4，r=1.000 0。结果表明，吴茱萸碱、吴茱萸次碱分别在1.2～60 μg/mL、0.20～20.1 μg/mL范围内，线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品溶液 (质量浓度分别为 7.5 μg/mL和 6.7 μg/mL)10 μL，分别在1 d内重复测定6次，每次进样3针，以平均峰面积计算日内精密度，RSD分别为1.47%、1.23%;在6 d内每天测定1次，每次进样3针，以平均峰面积计算日间精密度，RSD分别为2.33%、2.90%。结果见表2和表3。结果表明，仪器的精密度良好。

2.2 体外透皮吸收实验

2.2.1 裸鼠皮肤的处理［8］取6～8周龄的裸鼠，处死后小心剥离腹部皮肤，剔除皮下脂肪组织及黏连物;用生理盐水反复冲洗干净，置于－20℃冰箱中保存备用。实验前自然解冻，每次实验前检查皮肤的完整性，不能有任何破损。

2.2.2 体外透皮吸收实验方法 将处理好的裸鼠腹部皮肤固定于扩散池的供给池与接受池之间，角质层面向供给池。供给池中加入1.5 mL吴茱萸提取物及相应的促渗剂，接受池中加入7 mL 30%乙醇至70%生理盐水溶液作为接收介质，排出气泡使液面恰与皮肤内层接触。调节扩散仪至恒温(32±1)℃，恒速搅拌 (约200 r/min)，分别于搅拌开始后 0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h从样品接受池中抽取1 mL接受液，同时补加同温度同体积接收液。将各个时间点取出的接受液用0.22 μm微孔滤膜过滤后，供HPLC进样分析，并以此计算累积渗透量及渗透系数。

依法测定供试品液中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的量，并按下式计算累积渗透量 (Q)、渗透速率常数 (J)和增渗倍数 (ER)。

式中，Q为t时间药物的面积透过量 (μg/cm);Cn为第n个取样点测的的药物质量浓度(μg/mL);Ci为第i个取样点测得的药物质量浓度(μg/mL);J为透皮速率常数 ［μg/(cm·h)］;J0为未加促渗剂的透皮速率常数 ［μg/(cm·h)］;W为24 h药物的总透过率;M为供体池中药物的量(μg)。

2.2.3 相同质量分数条件下不同促渗剂对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响 在供体池中分别加入3%的氮酮、油酸和1，2-丙二醇作为促渗剂，以不加任何促渗剂组为空白对照，按2.2.2项下试验，结果见表1和图2。

表1 相同浓度不同促渗剂对吴茱萸提取物经皮吸收的影响结果(±s，n=5)Tab.1 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

表1 相同浓度不同促渗剂对吴茱萸提取物经皮吸收的影响结果(±s，n=5)Tab.1 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

注:与空白组相比，＊＊P ＜0.01。

－2.964 5 0.985 9 0.386 9±0.11 0.93成分 促渗剂 Higuchi方程 R J/(μg·cm－2·h－1) ER空白 Q=1.233 2t－3.300 1 0.992 1 1.233 2±0.82 1吴茱萸碱 氮酮 Q=3.259 6t－14.831 4 0.979 3 3.259 6±0.52＊＊ 2.64油酸 Q=3.445 9t－5.967 3 0.987 2 3.445 9±0.67＊＊ 2.79丙二醇 Q=3.019 2t－1.694 3 0.997 2 3.019 2±0.26＊＊ 2.45空白 Q=0.414 2t－2.810 8 0.994 5 0.414 2±0.09 1吴茱萸次碱 氮酮 Q=0.531 4t－4.043 8 0.993 1 0.531 4±0.19 1.28油酸 Q=1.054 3t－1.439 2 0.950 3 1.054 3±0.12＊＊ 2.54丙二醇 Q=0.386 9t

图2 3%用量的促渗剂对吴茱萸提取物经皮吸收的影响Fig.2 Effect of different kinds of enhancers on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract

通过表和图可以看出，3种促渗剂的质量分数为3%对吴茱萸碱与吴茱萸次碱的促渗效果依次为油酸＞氮酮＞1，2-丙二醇，且油酸对吴茱萸碱与吴茱萸次碱的渗透速率均明显高于空白组 (P＜0.01)。可进一步研究不同用量的油酸对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响。

2.2.4 不同用量的油酸对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响 在供体池中分别加入3%、5%、7%的油酸作为促渗剂，以不加任何促渗剂组为空白对照，按2.2.2项下试验，结果见表2和图3。

表2 不同用量油酸对吴茱萸提取物经皮吸收结果(±s，n=5)Tab.2 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

表2 不同用量油酸对吴茱萸提取物经皮吸收结果(±s，n=5)Tab.2 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract(±s，n=5)

注:与空白组相比，＊＊P ＜0.01。

3%油酸 Q=3.445 9t－5.967 3 0.987 2 3.445 9±0.67＊＊ 2.79 5%油酸 Q=3.563 3t－0.900 5 0.994 2 3.563 3±0.71＊＊ 2.89 7%油酸 Q=3.634 9t－0.074 3 0.997 7 3.634 9±0.51＊＊ 2.94空白 Q=0.414 2t－2.810 8 0.994 5 0.414 2±0.09 1吴茱萸次碱成 分 用 量 Higuchi方程 r J/(μg·cm－2·h－1) ER空白 Q=1.233 2t－3.300 1 0.992 1 1.233 2±0.82 1吴茱萸碱3.00 3%油酸 Q=1.054 3t－1.439 2 0.950 3 1.054 3±0.12＊＊ 2.54 5%油酸 Q=1.155 7t－0.367 2 0.966 0 1.155 7±0.24＊＊ 2.79 7%油酸 Q=1.242 1t－0.725 5 0.998 7 1.242 1 ±0.29＊＊

图3 不同用量油酸对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响Fig.3 Effect of different amounts of oleic acid on transdermal absorption of Evodia rutaecarpa extract

结果表明，对于吴茱萸碱和吴茱萸次碱而言，3组不同用量的油酸对吴茱萸碱与吴茱萸次碱的渗透速率均明显高于空白组 (P＜0.01)，且依次为7%油酸＞5%油酸＞3%油酸。

3 讨论

吴茱萸碱与吴茱萸次碱的体外经皮渗透具有渗透速率慢、时滞长、累积渗透量少的特点［9］，而添加促渗剂是改善其经皮渗透的重要方法，本实验选用了几种常见的促渗剂种类，对3种不同促渗剂及其不同用量油酸对吴茱萸提取物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的经皮吸收行为进行考察。

从相同质量分数条件下，不同促渗剂对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响的实验结果，油酸的促渗作用远远大于其他促渗剂。Naik等［10］证实油酸通过增加角质层脂质相分离和流动性发挥促渗作用。油酸具有良好的脂溶性，能增加角质层脂质的流动性，降低角质层的屏障作用，并提高吴茱萸碱与吴茱萸次碱分配和渗透速率，缩短其时滞，增加吴茱萸碱与吴茱萸次碱的累积渗透量，实现快速起效。

从不同用量的油酸对吴茱萸提取物的经皮吸收的影响的实验结果来看，油酸用量越高，对吴茱萸碱和吴茱萸次碱的促渗效果越好，最终筛选出以7%用量的油酸作为促渗剂时可以较好的促进吴茱萸碱和吴茱萸次碱的经皮吸收，该研究结果为吴茱萸外用制剂的制备和临床用药剂量提供合理的数据和参考。

［1］Rang W Q，Du Y H，Hu C P，et al.Protective effects of calcitonin gene-related Peptide-mediated evodiamine on guinea-pig cardiac anaphylaxis［J］.Maunyn Schmidebergs Arch Pharmacol，2003，367(3):306-311.

［2］Choi Y H，Shin E M，Kim Y S，et al.Anti-inflammatory principles from the fruits ofEvodia rutaecarpaand their celluar action mechanisms［J］.Arch Pharm Res，2006，29(4):293-297.

［3］Kobayashi Y.The nociceptive and anti-nociceptive effects of evodiamine from fruits ofEvodia rutaecarpain mice［J］.Planta Med，2003，69(5):425-433.

［4］Shyr M H，Lin L C，Lin T Y，et al.Determination and pharmacokinetics of evodiamine in the plasma and feces of conscious rats［J］.Analytica Chimica Acta，2006，558(1-2):16-21.

［5］Pruasnitz M R，Mirtagorti S，Lnager R.Current status and future potential of transdemral durg delivey［J］.Nat Rev Drug Discov，2004，13(12):115-124.

［6］Suhonen T M，Bouwstra J A，Urtti A.Chemieal enhancement of percutaneous absorption in relation to stratum corneum structural alterations［J］.J Control Release，1999，59(2):149-161.

［7］谢 娟，张启云，余日跃，等.吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的高效液相色谱含量测定［J］.时珍国医国药，2008，19(7):1570-1572.

［8］李 锐，周莉玲，刘 强.不同实验皮肤对青藤碱透过行为的影响［J］.中药材，1998，21(11):580-583.

［9］陈 菲.吴茱英提取物纯度与体外经皮渗透的关系及其镇痛作用研究［D］.长沙:中南大学，2011.

［10］Naik A，Pechtold L，Potts R O，et al.Mechanism of oleic acidinduced skin penetration enhancementin vivoin humans［J］.J Control Release，1995，37(3):299-306.