组织因子途径抑制物2在胃间质瘤组织中的表达及临床意义

邓蓓蓓，王贵军，王玉彬，李迪诺，李 谌

1辽宁医学院附属第一医院 妇科，辽宁锦州 121001；2辽宁医学院附属第一医院 普外科，辽宁锦州 121001；3辽宁医学院附属第一医院 辽宁省医学组织工程重点实验室，辽宁锦州 121001

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors，GISTs)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，占胃肠道肿瘤1%~4%，近十年来，无论是基础研究还是临床治疗领域，对其临床特点、病理改变、免疫表型、遗传学特征已清晰。然而在肿瘤的发病机制、生物学行为预测、药物治疗等方面还有许多问题尚待解决[1]，如何控制肿瘤的侵袭与转移仍是其治疗面临的主要问题[2-3]。组织因子途径抑制物 2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)在多种肿瘤中表达下调，与肿瘤的侵袭及转移有关[4-5]。我们采用免疫组织化学、RT-PCR和Western blot方法检测胃间质瘤组织中TFPI-2的表达，探讨其与胃间质瘤侵袭转移的关系，以期为治疗胃间质瘤及改善其预后提供新思路。

材料和方法

1 标本收集 收集我院2006年1月-2012年4月手术切除的新鲜胃间质瘤标本72例，男35例，女37例，年龄33~78岁，中位年龄56.4岁；肿瘤侵袭临近器官或组织，或有远处转移者20例，无侵袭转移者52例。取材在手术标本离体30 min内进行，每例均取肿瘤中心处非坏死瘤组织、肿瘤旁组织和正常组织，标本立即置于-80 ℃冰箱保存。胃间质瘤诊断标准：常规形态符合GISTs诊断要点，免疫组织化学CD117阳性；或常规形态符合GISTs诊断要点，CD117阴性而CD34阳性；或常规形态符合GISTs诊断要点，CD117、CD34阴性，并且平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)、结蛋白(desmin)、神经脊突细胞抗原(S-100)蛋白也均阴性，排除平滑肌源性和神经源性肿瘤。依据Fletcher等[6]提出的GISTs生物学行为分级标准进行分级(NIH分级)：肿瘤直径＜2 cm和核分裂相＜5/50 HPF为极低度侵袭危险性(Ⅰ级)；肿瘤直径2~5 cm和核分裂相＜5/50 HPF为低度侵袭危险性(Ⅱ级)；肿瘤直径5~10 cm和核分裂相＜5/50 HPF或肿瘤＜5cm和核分裂相6~10/50 HPF为中度侵袭危险性(Ⅲ级)；肿瘤直径＞5 cm和核分裂相＞5/50 HPF或肿瘤＞10 cm或核分裂相＞10/50 HPF为高度侵袭危险性(Ⅳ级)。本实验经医院伦理委员会同意。

2 免疫组化测定 将收集的组织石蜡包埋制成4 μm厚的切片，免疫组化染色步骤按试剂盒(sp0023，北京博奥森生物技术有限公司)说明书进行。TFPI-2一抗(北京博奥森生物技术有限公司)稀释比例为1∶400。免疫组化着色强度评分：0分为无；1分为弱；2分为强。阳性细胞评分按百分率递增：0分为＜5%；1分为≥5%，＜10%；2分为≥10%，＜30%；3分为≥30%，＜50%；4分为≥50%。着色强度计分与阳性细胞率计分之乘积为该病例评分值，评分值≤2分为阴性；≥3分为阳性。

3 RT-PCR测定 取每部位组织200 mg，提取总RNA。取2 μg总RNA，采用一步(One Step)RT-PCR法，根据试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明操作，TFPI-2和β-actin的上、下游引物均由上海生工生物工程有限公司合成，人类TFPI-2的PCR上、下游引物分别为5'-TCTGCCAATGTGACTCGC TAT-3'和 5'-TATTGTCATTCCCTCCACAGC-3'，合成产物为88bp，β-actin的上、下游引物分别为5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'和5'-AAGGAAGG CTGGAAGAGTGC-3'，合成产物为216bp。按下述条件进行循环：50 ℃反转录30 min，94 ℃2 min灭活逆转录酶，然后进行30个周期的PCR扩增反应，每个周期为94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。TFPI-2和β-actin的反应条件相同。PCR扩增产物在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照相并保存。

4 Western blot测定 取200 mg组织块置于匀浆器中球状部位，用剪刀将组织块尽量剪碎。加400 μl裂解液，裂解30 min后在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清测蛋白浓度后分装于0.5 ml离心管中，样品中加入缓冲液于沸水中煮5 min使蛋白变性。SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶80 V，分离胶150 V，将凝胶中的蛋白用湿转法转印至0.45 μm的PVDF膜上。转膜结束后，将膜置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后分别加入兔抗人的TFPI-2和β-actin抗体，置于4 ℃冰箱摇床孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗1∶1 000，于室温孵育60 min，洗膜后放入暗盒显色。

5 统计学分析 应用SPSS16.0软件进行统计分析，计量数据以表示，两样本间均数比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，计数数据比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组化测定 阳性反应为棕黄色颗粒，主要位于胞浆。TFPI-2蛋白在正常组织、瘤旁组织及瘤中心处组织中均有表达，但在正常组织中的表达要强于瘤旁组织及瘤中心处组织，瘤旁组织中的表达亦强于瘤中心处组织(图1)。瘤组织中TFPI-2的阴性表达率在性别和年龄上无统计学差异，在肿瘤有无侵袭转移上存在统计学差异(P＜0.05)，见表1。

表1 TFPI-2蛋白表达与性别、年龄、肿瘤侵袭转移的关系Tab.1 Relation of TFPI-2 protein expression with gender and age of patients, tumor invasion and metastasis(n, %)

2 RT-PCR测定 TFPI-2 mRNA在正常组织及瘤旁组织中高表达，在瘤中心组织中低表达(P＜0.01，图2，表2)。在瘤组织中的表达水平随NIH分级增高而下调(P＜0.01)。TFPI-2 mRNA表达在性别和年龄上无统计学差异，在肿瘤有无侵袭转移上存在统计学差异(P＜0.05)，见表3。

3 Western blot测定 TFPI-2蛋白在正常组织及瘤旁组织中高表达，在瘤中心组织中低表达(P＜0.01，图3，表2)。在瘤组织中的表达水平随NIH分级增高而下调(P＜0.01)。TFPI-2蛋白表达在性别和年龄上无统计学差异，在肿瘤有无侵袭转移上存在统计学差异(P＜0.05)，见表3。

表2 TFPI-2在不同部位的表达情况Tab.2 TFPI-2 mRNA and protein expression in different tissues

表3 瘤组织TFPI-2的表达与临床病理特征的关系Tab.3 Relationship between TFPI-2 expression and clinicopathologic characteristics of gastric stromal tumor

图1 TFPI-2蛋白在瘤组织、瘤旁组织和正常组织中的表达(×400) A:正常组织； B:瘤旁组织； C:瘤组织Fig.1 TFPI-2 protein expression in normal gastric tissue (A), adjacent stromal tumor tissue (B) and stromal tumor tissue (C) (×400)

图2 TFPI-2 mRNA在瘤组织、瘤旁组织和正常组织中的表达1: Marker; 2:瘤组织; 3: 瘤旁组织; 4: 正常组织Fig.2 TFPI-2 mRNA expression in tumor tissue, its adjacent tissue and normal tissue 1: Marker; 2:Tumor tissue; 3: Adjacent tumor tissue; 4: Normal tissue

图3 TFPI-2蛋白在瘤组织、瘤旁组织和正常组织中的表达1: 瘤组织; 2: 瘤旁组织; 3: 正常组织Fig.3 Protein expression of TFPI-2 at center and periphery of tumor and at nearby normal tissue 1: Tumor tissue; 2: Adjacent tumor tissue;3: Normal tissue

讨 论

局限性GIST的生物学行为目前主要依据肿瘤大小和核分裂象数评估其恶性危险程度，本研究采用Fletcher等提出的按危险程度分为极低、低、中和高4级分类方案。研究发现，TFPI-2不但在瘤组织、瘤旁组织和正常组织中表达有差异，在不同级别中的表达也存在统计学差异。另外，我们发现在肿瘤有无侵袭或转移上，TFPI-2的表达也存在差异，肿瘤有侵袭或转移者，TFPI-2的表达明显下降。

TFPI-2是丝氨酸蛋白酶抑制物，能有效抑制基质金属蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶等多种蛋白水解酶的活性，已有实验证实，TFPI-2能抑制神经胶质瘤[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]、喉癌[10]、胰腺癌[11]等细胞的生长、侵袭和转移。

本研究结果表明，TFPI-2的表达在肿瘤组织及瘤旁组织中受到抑制，这一变化表明细胞外基质的稳定性可能因TFPI-2的抑制而降低。胃间质瘤中心组织TFPI-2的表达水平随着NIH分级升高而下调，并且TFPI-2表达在肿瘤有无侵袭转移上存在统计学差异，提示TFPI-2低表达可能促进胃间质瘤的生长、浸润及转移，导致预后不良。其可能的机理是，TFPI-2基因表达产物TFPI-2蛋白抑制多种蛋白水解酶的活性，降低蛋白水解酶对细胞外基质的破坏，而各种肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶所参与的细胞外基质的降解正是肿瘤发生侵袭和转移的关键步骤。另有研究[12]表明，TFPI-2基因表达对绒癌细胞的生长抑制可通过诱导细胞凋亡来实现，在胃间质瘤是否也是如此还需进一步实验证实。

综上所述，TFPI-2基因可能在胃间质瘤侵袭和转移过程中起重要作用，这为我们提供新的思路来判断胃间质瘤的恶性程度、预测转移及评估胃间质瘤患者的预后，相信随着研究的不断深入、广泛，TFPI-2在胃间质瘤的预防、诊断及基因治疗中将会有更美好的前景。

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