寻常型银屑病皮损处ASC和caspase-1的表达

胡 坚，杨闰平，李恒进，赵 华

解放军总医院 皮肤科，北京 100853

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，多被认为由T淋巴细胞介导，但近年来研究发现多种固有免疫细胞和成分也在银屑病的发病中起到了重要作用。其中凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)是NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)炎症小体的组成部分。NLRP3炎症小体作为一种固有免疫系统NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-，NOD)家族的胞内模式识别受体，通过识别多种内源性和外源性危险信号，合成和释放IL-1β和IL-18参与炎症反应并启动T细胞的免疫反应[1-2]。以往研究发现，NLRP3炎症小体参与了类风湿性关节炎、2型糖尿病、克罗恩病等疾病的发生[3]，而银屑病同样作为一种非感染性炎症性疾病，NLRP3炎症小体是否参与其发病研究尚少。我们采用免疫组化方法对寻常型银屑病皮损中ASC和caspase-1的表达进行了检测，并与正常人对照。

对象和方法

1 研究对象 2011年2月-2012年5月我科门诊确诊的寻常型银屑病30例，其中首次发病5例，复发25例，均为进展期，男18例，女12例，年龄23~54(40.45±9.58)岁，病程2个月~20年，银屑病皮损面积和严重程度指数评分为5.61~20.10(12.34±5.02)分，所有患者2个月内无系统用药，2周内未使用银屑病外用药物。正常对照20例，年龄、性别与银屑病患者匹配，为我科色痣患者切除时距离色痣边缘3 mm以外的周边正常组织。

2 免疫组化检测 小鼠ASC、caspase-1多克隆抗体购自美国Abcam公司。常规方法制作标本，2 μm厚度连续切片，Elivision免疫组化染色：高压锅加热修复，双氧水消除过氧化酶，分别滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗，4 ℃湿盒过夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，室温静置20 min后PBS再洗3次，加三抗，操作步骤同前。DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

3 结果判定 以细胞质和细胞核棕黄色或棕褐色为阳性。由两位医生对免疫组化染色进行评估。每张切片随机观察5个视野(×400)，计算平均每100个角质形成细胞中染色阳性细胞百分比，以及染色强度进行综合评分。根据阳性细胞比例，＜5%、5~25%、26%~50%、51%~75%和 ≥76%分别计为0~4分；并按染色强度无、弱、中、强分别计为0~3分。综合两个指标将评分分为4级，0分为阴性、1~3分为弱阳性、4~5分为阳性、6~7分为强阳性。

4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，两独立样本正态分布定量资料，但组间方差不齐，采用Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ASC两组表皮中的表达 银屑病患者皮损处表皮全层强阳性表达ASC，主要分布在胞浆、胞核，少数表达于胞膜，免疫组化综合评分为4.48±0.36；正常人对照ASC主要表达于表皮中、下部，胞膜、胞浆、胞核均有表达，以轻、中度表达为主，免疫组化综合评分为2.10±0.24。两组比较差异有统计学意义(t=49，P＜0.01)，见图1。

2 Caspase-1两组表皮中的表达 在银屑病患者皮损处caspase-1亦表达于表皮全层，位于胞浆，染色呈强阳性，免疫组化综合评分为3.95±0.53；正常人对照caspase-1表达于基底细胞和棘细胞层下部，染色强度较弱，免疫组化综合评分为1.48±0.22。两组比较差异有统计学意义(t=55，P＜0.01)，见图2。

讨 论

在银屑病的发病机制中，T淋巴细胞介导的适应性免疫反应被认为具有重要作用。固有免疫系统通过产生和释放一系列细胞因子、趋化因子、内源性抗微生物物质及激活固有免疫细胞和转录因子来消除外来病原，并启动适应性免疫反应，其可能的作用途径有：1)Toll样受体(TLRs)：研究发现，银屑病皮损处表皮上层角质形成细胞高表达TLR1、TLR2，低表达TLR3、TLR4，此外使用TLR7激动剂咪喹莫特可加重银屑病皮损。TLR作为一种模式识别受体，通过MyD88/IRAK/TRAF6信号转导途径激活NF-κB，从而激活下游免疫反应。2)抗菌肽(AMPs)：由角质形成细胞和免疫细胞表达。AMPs除杀伤微生物外，AMPs的高表达可能通过募集炎症细胞而促进局部炎性反应、血管生成、角质形成细胞增殖，从而形成银屑病皮损。3)角质形成细胞：作为一种前炎性细胞生产TNF-α、IL-1α、IL-6等细胞因子，继而诱导IL-8等趋化因子的产生而趋化中性粒细胞和T淋巴细胞。4)NKT细胞：生成IFN-γ启动适应性免疫，IFN-γ是导致银屑病的重要介质。5)DC细胞：表达自身肽/MHC复合物诱导T细胞的失能以及Treg细胞的产生，从而打破免疫活性和免疫耐受的平衡，诱导慢性炎症反应，并可加强NKT细胞的活性。6)补体系统：C5a等诱导中性粒细胞和淋巴细胞浸润，C5b-9也可能促进角质形成细胞的增殖[4-5]。

图 1 a： SC表达于银屑病皮损处表皮全层 ，呈强阳性 ，免疫组化(×200)； b： ASC在正常人表皮表达较弱，免疫组化(×200)图 2 a： caspase-1表达于银屑病皮损处表皮全层，呈强阳性 ，免疫组化(×200)； b： caspase-1表达于正常人表皮中、下部，且染色强度弱，免疫组化(×200)Fig. 1 a:Immunohistochemical staining of ASC in psoriasis vulgaris patients(×200); b: Immunohistochemical staining of ASC in epidermis of normal persons(×200)Fig. 2 a: Immunohistochemical staining of caspase-1 in psoriasis vulgaris patients(×200); b: Immunohistochemical staining of caspase-1 in epidermis of normal persons(×200)

NLRP3炎症小体是近年来引起关注的一种固有免疫系统的胞浆内模式识别受体，是由NLRP3、接头蛋白ASC、半胱氨酸蛋白酶前体procaspase-1共同形成的功能性多蛋白复合体。NLRP3炎症小体作为固有免疫和适应性免疫之间的重要联系，通过识别内源性与外源性危险信号，参与启动适应性免疫应答。ATP、ROS、紫外线、微生物及其产物等促使NLRP3在胞浆内寡聚并募集ASC和前caspase-1，前caspase-1自活化形成caspase-1，裂解前IL-1β和前IL-18为有活性的IL-1β和IL-18[6]。IL-1β 和IL-18同属IL-1家族，被认为在银屑病等炎症性皮肤病的发病中发挥重要作用[7]。IL-1β和IL-18调节Th17细胞分化，促进IL-17产生，同时诱导IFNγ的产生。此外NLRP3炎性小体还参与、促进初始T细胞形成Th1和Th17效应细胞，从而参与银屑病发病过程[1-8]。

本实验结果表明，银屑病皮损处ASC和caspase-1在表皮全层强阳性表达，ASC在正常对照组虽然全层表达，但染色强度较弱；而caspase-1在正常对照组仅表达在基底层细胞和棘细胞层下部。国外研究亦显示，银屑病皮损处ASC和caspase-1表达增强，caspase-1的活化以及之后的IL-1β和IL-18的产生、分化、成熟对于银屑病的炎症过程具有关键作用[7-9]。高表达的ASC和caspase-1提示银屑病皮损中NLRP3炎症小体活性增强，NLRP3炎症小体通过诱导IL-1β、IL-18的合成，启动了Th1和Th17细胞介导的适应性免疫应答和炎症反应，促进了银屑病的发生和发展，同时也提示角质形成细胞作为一种重要的免疫细胞参与了发病过程[10]。新近研究还发现NLRP3基因rs10733113位点的单核苷酸多态性与银屑病的遗传易感性相关，该发现支持固有免疫在银屑病的发病机制中发挥作用[3]。

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2 林静，李大主. 细胞焦亡：一种新的细胞死亡方式［J］. 国际免疫学杂志，2011，34（3）：213-216.

3 Carlström M， Ekman AK， Petersson S， et al. Genetic support for the role of the NLRP3 inflammasome in psoriasis susceptibility［J］. Exp Dermatol， 2012， 21（12）： 932-937.

4 Büchau AS， Gallo RL. Innate immunity and antimicrobial defense systems in psoriasis［J］. Clin Dermatol， 2007， 25（6）： 616-624.

5 Bos JD， de Rie MA， Teunissen MB， et al. Psoriasis： dysregulation of innate immunity［J］. Br J Dermatol， 2005， 152（6）： 1098-1107.

6 江兴林，左云飞. 细胞凋亡相关斑点样蛋白与半胱氨酸蛋白酶-1在肝癌中的表达及临床意义［J］. 中国医师杂志，2011，13（5）：584-586.

7 Johansen C， Moeller K， Kragballe K， et al. The activity of caspase-1 is increased in lesional psoriatic epidermis［J］. J Invest Dermatol，2007， 127（12）： 2857-2864.

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9 Salskov-Iversen ML， Johansen C， Kragballe K， et al. Caspase-5 expression is upregulated in lesional psoriatic skin［J］. J Invest Dermatol， 2011， 131（3）： 670-676.

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