稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立

李云奇，肖 毅，董金凯，王 伟，田仁礼，殷小涛，林晓亮，于继云，高江平解放军总医院 泌尿外科，北京 10085；军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850；解放军第07医院 泌尿外科，北京 100071

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是肾脏恶性程度较高的肿瘤之一，也是泌尿系常见的肿瘤。过去30年中肾细胞癌的发病率逐年上升[1-3]。病人确诊时已经到了晚期，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20%~30%会发生转移，对于失去手术机会的RCC目前还没有令人满意的治疗方法[4-5]。因为它的免疫原性很高，对放化疗都不敏感，所以免疫治疗的方法作为一种新的治疗手段被给予了厚望，成为研究热点[6-8]。

本实验利用PCR技术扩增出人RCC细胞上一种膜表达抗原G250的全长基因，根据DNA重组技术将其定向插入到pIRES-neo真核表达载体中。通过脂质体转染的方法，导入renca细胞中，经过G418的加压，建立可以稳定表达人G250基因的小鼠renca细胞株，为后续肾癌疫苗的免疫应答奠定了基础。

材料和方法

1 主要材料及试剂 大肠埃希菌DH5α和小鼠renca细胞为本实验室保存，pIRES-neo真核表达载体购自Clontech公司，T4DNA连接酶，高保真PyrobestTMExTaq聚合酶是TaKaRa公司的产品，G418，PCR所用的酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，RT-PCR是toyobo公司产品，兔抗人一抗购自Santa cruz公司，FITC标记的二抗购自北京中桥技术有限公司，细胞培养用的RPMI1640来自Thermo公司，胎牛血清来自Hyclone公司，研究所用引物由Invitrogen公司合成，lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司。转染用小提试剂盒是北京天根生物技术有限公司产品，凝胶回收试剂盒，质粒回收试剂盒为北京三博远志产品。

2 人G250基因的扩增 以我们实验室前期构建的含有G250基因载体的质粒为模板，PCR扩增G250基因。反应体系参照EXTaq酶的说明书，50 μl，反应条件是95 ℃，预变性6 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共扩增出32个循环，72 ℃延伸7 min。扩增引物，上游引物：GCAATTG CAGAGGTTGCCGGATGCAG；下游引物：GAGATC TCTAGGCTAGTCTCGGCTAC。引物是由Invitrogen生物技术有限公司合成。

3 人G250真核表达载体的构建 首先将PCR产物进行切胶回收纯化，和pIRES-neo真核表达载体质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化，T4DNA连接酶连接后转化入大肠埃希菌DH5α，挑出阳性克隆进行双酶切和PCR鉴定，将分析正确的阳性克隆质粒进行保存，并且命名为pIRES-neo-G250。

4 细胞转染及克隆筛选 首先做预实验，以10 d杀死全部未转染renca细胞G418的最低浓度为最终筛选浓度，结果确定实验G418筛选浓度为600 mg/L。在转染的前1 d，取对数生长期的renca细胞，用胰酶消化后接种于六孔板中，当细胞汇合度达到60%~70%时，将提取的转染质粒pIRES-neo-G250和空载体pIRES-neo在LipofectamineTM2000的介导下转染入renca细胞，方法按照LipofectamineTM 2000说明书。在48 h之后，将六孔板中细胞用胰酶消化，以1∶3的比例传代，56 h后，按每瓶600 mg/L终浓度加入G418。约7 d，细胞出现大量死亡，此时每隔1 d换1次液，持续加压到细胞不再死亡且以团簇生长为止。

5 Western blotting检测G250蛋白表达 取对数生长期的细胞，提取细胞蛋白质变性加热后，10%的SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉Tris盐溶液室温震荡封闭2 h。1∶500稀释的人G250抗体作为一抗，1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，分别孵育后进行显影定影。

6 流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测 取对数生长期的细胞，用预冷的含2%的新生牛血清的PBS清洗细胞3次，实验组和对照组细胞同时用兔抗人的一抗4 ℃孵育40 min，含2%的新生牛血清的PBS清洗细胞3次后，同时加入FITC标记的二抗山羊抗兔IgG，4 ℃孵育40 min，2%的新生牛血清的PBS清洗细胞3次后，进行流式细胞术检测，将检测后的renca细胞进行滴片后激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

结 果

1 人G250真核表达载体的构建及鉴定 重组真核表达质粒pIRES-neo -G250用EcoRI和BamHI双酶切后呈现约1 100 bp和5 500 bp左右的两条目条带，与预期大小一致。将鉴定正确的质粒送到Invitrogen生物技术有限公司测序，结果与当初预计的基因序列完全相同，说明构建的质粒正确。见图1。

图 1 pIRES-neo-G250酶切电泳图M： DL2000标志物； 1： pIRES-neo质粒； 2： 酶切后质粒Fig. 1 Enzyme digestion electrophoresis of pIRES-neo-G250 M：DL 2000 maker; lane 1：pIRES-neo plasmid; lane 2： products after restriction enzyme digestion(EcoRI/BamHI)

图 2 Western blotting检测结果 1：转染pIRES-neo -G250；2： 转染pIRES-neoFig. 2 Western blotting showing pIRES-neo-G250 in experiment group (1) and pIRES-neo in control group (2)

2 Western blotting检测G250蛋白表达 稳定转染pIRES-neo-G250的renca细胞能够检测到G250的蛋白条带，而对照组则没有相应的条带，用GADPH作为内参，与预期一致。见图2。

图 3 流式细胞图分析 A： 转染pIRES-neo； B： 转染pIRES-neo -G250Fig. 3 Flow cytometry showing pIRES-neo and pIRES-neo-G250 in control group (A) and experiment group (B)

图 4 激光共聚焦检测 A，B： 转染pIRES-neo； CD： 转染pIRES-neo -G250； AC： 荧光图； BD： 明场图Fig. 4 Immunofluorescence confocal assay showing pIRES-neo in control group (A, B) and pIRES-neo-G250 in experiment group (C, D)

3 Renca细胞的流式细胞术和激光共聚焦检测流式细胞术(图3)和激光共聚焦显微镜(图4)检测结果显示，稳定转染pIRES-neo-G250的renca细胞用特异性抗体检测得到了高效的荧光表达，而对照组则没有。

讨 论

G250是一种膜表达抗原，它与具有碳酸酐酶活性的细胞黏附因子-碳酸酐酶9(MN/CA IX)的基因结构完全相同，因此命名为G250- MN/CA IX，简称G250。它是碳酸酐酶家族成员之一，基因位于染色体9p12-13上[9-10]。因为它表达与肾透明细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)细胞上的跨膜抗原表位，可以与G250抗体结合，显示有大多数的肾透明细胞癌和其他类型的肾透明细胞癌都有G250的表达，而在正常组织中很少或根本不表达[11-12]。所以它在RCC细胞中的这种特性使它成为肿瘤疫苗潜在的靶抗原和肿瘤治疗的重要靶位[13-14]。G418是一种氨基糖苷类抗生素，它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长，大大降低了筛选的时间[15-16]。

为了验证此细胞株稳定表达G250的能力，笔者又对其反复冻存和复苏以及连续传代后的细胞进行了检测，能够达到预期目标。综上所述，我们成功构建了pIRES-neo-G250真核表达载体，转染及筛选了稳定表达G250的细胞株。为进一步研究以人G250为靶抗原构建的肾癌基因疫苗提供了很好的细胞株，同时也为G250在肾癌免疫治疗中的应用奠定了基础。

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