血脂平稳度对兔动脉粥样硬化病变进展的影响

邹 晓，司全金，蔡力力

解放军总医院，北京 100853 1南楼心血管一科；2南楼临床检验科

血脂代谢紊乱与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成密切相关，研究显示，血脂持续异常是促进AS发生及发展的重要因素，但临床中常常有部分患者既往存在血脂水平升高，但急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)发生时低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)反而处于较低水平，因此，粥样斑块的稳定性是否与血脂水平波动有关不得而知。该研究通过制造血脂波动模型，观察血脂水平显著波动与斑块稳定性之间的关系，进一步探讨血脂异常影响动脉粥样斑块的方式及机制。

材料与方法

1 试剂及仪器 高脂、低脂及普通饲料(北京市科傲公司)，血脂及ELISA试剂盒(罗氏公司)；Thermo IEC CL40离心机(公司)，全自动生化分析仪(Roche Hitachi917型(公司)，瑞典产LKB-Ⅲ型超薄切片机，OLYMPUS BX60型双目显微镜。西门子公司SEQUOIA512型超声仪，探头频率8~14 MHz。

2 实验动物与分组 24只12周龄的健康雄性新西兰大耳兔，体质量2.0~2.5 kg，由本院实验动物中心提供(许可证编号：SCXK(京)2007-0003)，环境适应饲养1周后随机分为3组：空白组(A)6只，饲普通料；对照组(B)9只，持续以含1%胆固醇、3%猪油的高脂饲料饲养；血脂波动组(C)9只，高脂饲料饲养至12周动脉粥样硬化模型成功建立后，与低脂饲料每隔3周交替喂养1次，即12周换低脂饲料、15周换高脂饲料、18周换低脂饲料、21周换高脂饲料[1]。3组动物饲料120 g/d，自由饮水，共喂养24周。实验过程中因腹泻及不明原因死亡4只，剩余20只纳入有效样本统计分析。

3 血清生化检测及主动脉超声检测 A、B两组于0、12、24周末、C组于0、12、15、18、21、24周末经兔耳缘静脉空腹采血，血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C检测采用罗氏公司试剂在本院生化室用免疫比浊法完成，ELISA法测血清超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)水平。根据血脂原始参数计算血脂平稳度，以血脂平稳指数(smoothness index，SI)表示，SI=-x/s(-x与s分别指12~24周5次采血各血脂水平的均值与标准差)，SI值越高说明血脂平稳度越好，反之则说明血脂水平波动大。应用超声仪于实验开始、12周末及24周末行腹主动脉超声检测。

4 病理形态学观察 24周末处死动物，取主动脉剥离外膜脂肪组织，纵行剖开置于多聚甲醛中固定保存。大体标本行油红染色后摄像，利用生物医学图像分析系统(Image-pro plus)测定斑块面积和内膜面积，计算斑块与内膜面积百分比。于主动脉弓处取材，常规石蜡包埋，制成厚约5 μm横截面切片，行苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察超微结构。

5 数据处理 结果计算均采用-x±s表示，数据统计采用SPSS13.0软件分析。计量资料采用t检验和方差分析。

结 果

1 实验动物一般情况 实验过程中A组不明原因死亡2只，B、C组因腹泻各死亡1只，最终剩余20只动物资料纳入统计学分析。喂养24周后，各组动物体重均较喂养前显著增加(P＜0.01)，24周体重明显大于12周(A组P＜0.05，余P＜0.01)，但各组之间比较无统计学差异(P＞0.05)，见表1。

2 血脂参数、SI及血清hs-CRP变化 C组通过交替高低脂饲料，成功制作高低血脂波动模型(图1)。12周时，B组和C组动物血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均较0周及A组明显升高，HDL-C则较0周及A组显著降低(P＜0.01)；24周时，C组血清TC、LDL-C水平明显低于B组(P＜0.05)，血清hs-CRP水平明显高于12周水平及B组(P＜0.01)。24周时，B、C组SI均低于A组，C组TC与LDL-C SI值低于B组的12.51，见表1。

表1 三组体重、SI、血脂及hs-CRP比较Tab. 1 Weight, SI and serum lipid and hs-CRP level in 3 groups

图 1 C组不同周数血脂水平Fig. 1 Lipid level in group C at different weeks

3 主动脉超声 造模前3组兔腹主动脉均内壁光滑，内膜不易显示，管壁无隆起、增厚、斑块形成。高脂喂养后，动脉管壁表现内-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增厚，局部隆起甚至多发斑块形成。0周时，各组动物主动脉IMT无统计学差异，饲养12周后，B、C组IMT明显高于0周及空白对照组(P＜0.01)，且两组血管内可见明显斑块形成；24周时，C组IMT明显高于其12周值(P＜0.05)，且高于B组(P＜0.01)，见表2。另外，同一血管部位斑块不同周数比较，12周时B组斑块(0.74×3.46) mm、C组(0.80×4.9) mm，24周时B组(0.75×4.34) mm、C组(1.40×9.90) mm，可见C组斑块增长速度明显大于B组。

表2 三组不同周数IMT比较Tab.2 IMT in 3 groups at different weeks(mm)

图 2 主动脉粥样硬化病变血管内膜油红染色Fig. 2 Oil red staining of atherosclerotic intima

图 3 三组动脉粥样斑块HE切片比较Fig. 3 HE staining of atherosclerotic plaque sections from 3 groups A: normal intima in group A(×200); B：structure of atherosclerostic plaque in group B (×100); C：structure of atherosclerostic plaque in group C (×200); D：revas-cularization in group C(×400)

4 动脉粥样硬化斑块面积百分比 血管内膜油红染色显示，动脉粥样硬化病变处被染成红色(图2)。C组斑块面积百分比为(53.53±22.6)%，明显较B组(33.90±24.91)%高(P＜0.05)。肉眼下可见A组主动脉内膜光滑，未被油红着色，未见粥样硬化斑块；B组主动脉内膜有较严重的粥样硬化病变，可见脂样物质突出管腔，呈点、斑、条状隆起，边缘清楚，表面无明显破溃，较严重者斑块融合成片，以主动脉起始部为重；C组主动脉内膜有严重粥样斑块病变，密布内膜面，主动脉起始部严重，与B组相比斑块边缘不清楚，可见斑块表面不光滑表现，降主动脉病变较B组重。

5 HE染色切片 A组主动脉内膜光滑平整，可见排列整齐的内皮细胞，内膜未见泡沫细胞及脂质沉积；B组动脉可见明显动脉粥样硬化斑块，血管内膜明显增厚，内皮细胞脱落，管壁内见泡沫细胞形成，内膜下及斑块内有胆固醇结晶体形成，部分区域可见坏死及钙盐沉积；C组亦可见明显粥样斑块形成，与B组相比，斑块较厚但纤维帽较薄、脂核较大，部分斑块可见纤维帽被溶解征象，管壁内可见大量泡沫细胞及炎性细胞，斑块内可见新生血管形成(图3)。显微镜下主动脉弓处斑块及纤维帽厚度比较，C组斑块厚度(800.38±98.25) μm明显大于B组(675.00±109.67) μm(P＜0.05)，但纤维帽厚度(103.50±45.66) μm小于B组(295.83±97.90) μm(P＜0.01)。

讨 论

ACS的主要病理机制是不稳定的动脉粥样硬化斑块破裂及血栓形成，因此发现影响斑块进展速度的因素及预测动脉粥样斑块的稳定性具有十分重要的临床指导意义。影响稳定斑块进展为易损斑块的相关因素主要包括斑块自身结构即“大脂核”特征薄纤维帽、血管内皮功能异常、高胆固醇血症以及炎症反应等[2-5]；且发现血清标记物如MMP-9、IL-18等可以预测易损斑块[6-7]。众所周知导致动脉粥样硬化斑块的罪魁祸首是高水平的LDL-C，其通过氧化修饰成为ox-LDL，ox-LDL在动脉斑块的早期形成和后期进展中均发挥重要生物学效应，包括损伤血管内皮细胞、表达黏附分子、聚集白细胞以及形成泡沫细胞，其增加可导致粥样斑块由稳定向不稳定的易损斑块转化[8]。然而临床工作中，部分ACS患者发病时却表现出较低水平的LDL-C，由此推测血脂平稳度在斑块的进展中可能起到一定的作用。

本研究结果显示：血脂波动组TC、LDL-C的SI值分别为3.60、3.29，明显低于对照组的12.51、7.61。饲养12周后，与空白组及基础值相比，对照组和血脂波动组血清TC、TG、LDL-C及hs-CRP水平显著升高，差异有统计学意义；24周后，与对照组相比，血脂波动组hs-CRP水平明显升高。血脂波动组不同周数腹主动脉超声示血管内中膜厚度明显高于对照组，超声下24周与12周斑块大小比较可见血脂波动组进展速度较对照组快。主动脉形态学变化方面，对照组及血脂波动组主动脉内壁肉眼及光镜下均可见典型动脉粥样斑块，血脂波动组斑块面积百分比较对照组升高，但斑块纤维帽厚度较对照组薄(肩部明显)。另外，血脂波动组斑块纤维帽周围有大量炎性细胞浸润，部分区域可见新生血管及明显纤维帽不连续现象。本研究结果证实，血脂平稳度对动脉粥样硬化斑块的进展速度有所影响，且SI越小即血脂波动越大，斑块的发展速度越快。原因可能为炎症反应贯穿动脉粥样硬化斑块发生和进展的全过程，既往亦有文献证实hs-CRP与动脉粥样硬化斑块进展明显相关[9-11]。而本研究中血脂波动组hs-CRP水平较高，且切片中可见大量炎性细胞浸润，可推测不平稳的血脂水平造成斑块内炎症反应增加，而加剧的炎症反应导致动脉斑块进展速度加快。但是血脂水平波动究竟是通过何种机制导致血管内炎症反应增加，仍需进一步研究。

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