OCT4介导肝细胞去分化过程中巢蛋白的表达及意义探讨

李 冰，郭恩凯，郝好杰，申 晶，程 愈，韩为东，母义明

解放军总医院，北京 100853 1内分泌科；2分子生物学实验室

糖尿病是对人类健康威胁最为严重的疾病之一，现行的口服药物和胰岛素治疗容易造成血糖波动，不能从根本上治疗糖尿病[1]。因此人们开始寻求β细胞替代治疗的新来源。已有实验将胰腺发育的关键转录因子如Pdx-1等直接导入肝细胞中使之转变为胰岛素分泌细胞(insulin producing cell，IPC)，但效率较低，产生的IPC功能不完善[2-4]。OCT4是维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新能力的干性基因之一，有实验证实单独OCT4可使成体细胞去分化以实现细胞的重编程，如成纤维细胞向造血前体细胞的转变[5-7]。Nestin是多谱系前体细胞的标志物之一[8]。不同来源的巢蛋白(nestin)阳性细胞可体外诱导为神经细胞、平滑肌细胞、肝细胞以及胰腺内外分泌细胞[9-10]等。本实验拟探索肝细胞先经去分化再向IPC诱导的重编程路径，通过观察nestin在肝细胞经OCT4介导的去分化过程中的表达，为选择合适的诱导时机提供参考和依据。

材料和方法

1 实验材料 6~8周雄性C57BL/6小鼠从本院动物中心引进，饲养在无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房内。包装慢病毒所用的pwpt-GFP、psPAX2、p MDay2G质粒由第二军医大学细胞生物教研室胡以平教授提供，pwpt-OCT4质粒由本实验室构建，293T细胞由本实验室提供。肝细胞培养液购自ScienCell公司。高糖DMEM、Opti-MEM、RPMI Medium 1640、Knockout血清、非必需氨基酸(nonessential aminoacid，NEAA)、谷氨酰胺(L-glutamine)、β巯基乙醇(b-mercaptoethanol)、RNA提取试剂Trizol、Complete F12 Medium购自Invitrogen公司。胶原酶Ⅳ购自Sigma公司。碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)购自Peprotech公司。反转录试剂盒购自Famantas公司。2×Taq master Mix购自天根生物公司。RT-PCR引物由北京三博远志生物公司合成(见表1)。肝细胞灌流液1、灌流液2和黏附培养基配置参考文献[11]。其他化学试剂均为国产分析纯。小鼠原代肝细胞分离培养方法见参考文献[11]。

表1 各上下游引物序列Tab. 1 Sequences of different upstream primers

2 慢病毒包装及浓缩 培养293T细胞至融合度70%~80%，用定量的质粒(pwpt-GFP，psPAX2，p MD2G及pwpt-OCT4)及转染试剂PEI包装出表达OCT4或EGFP的慢病毒，浓缩后分别稀释至1.5×108pfu/ml。

3 OCT4-慢病毒感染原代肝细胞 使用肝细胞培养液在37 ℃、5% CO2条件下培养分离8 h后的肝细胞，感染0CT4-慢病毒(MOI=15)，并加入polybrene(4 μg/ml)，每次感染12 h，连续感染两次，中间间隔24 h。平行对照组感染EGFP-慢病毒，感染方式同OCT4-慢病毒组。感染结束后换为去分化培养液(Complete F12 Medium+10% knockout血清+1%NEAA+1 mmol/L L-glutamine + 0.1 mmol/L b-mercaptoethanol+10 ng/ml bFGF+10 ng/ml HGF)。

4 RT-PCR监测肝细胞感染OCT4-慢病毒后ALB、AFP、FOXA2及nestin的表达 将原代肝细胞(0 d)及感染OCT4-慢病毒后3、5、7、9、12、14、16和18 d的肝细胞使用Trizol提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪检测RNA的含量。使用Fermentas反转录试剂盒反转录成cDNA。取1 μl cDNA作为PCR模板，加入2×Taq PCR master Mix 12.5 μl(1×Taq PCR Master Mix)，上、下游引物各1 μl(终浓度0.4 μmol/L)，补足RNAase-free Water至总体积25 μl。以GAPDH作内参。每个基因每一时间点跑3次PCR，将得到的产物跑1%琼脂糖凝胶分析，产物使用柯达1D电泳分析软件分析，将检测基因(ALB，AFP，FOXA2及nestin)与对应时间点的GAPDH条带灰度作比，根据每个基因对应时间点的3次灰度比值求出均数，将均数和时间作图(见图6，7)。

结 果

1 小鼠原代肝细胞分离培养 本实验采用两步胶原酶灌流法，用黏附培养基培养6~8 h后肝细胞已贴壁，更换为肝细胞培养液。镜下观察：肝细胞活率在90%以上，细胞呈多边形或不规则形，肝细胞胞体大，多为双核，折光差，包浆内颗粒丰富。见图1。

2 OCT4-慢病毒感染肝细胞 为提高慢病毒的感染率，我们采用两次重复感染法。因EGFP-慢病毒与OCT4-慢病毒包装浓缩及稀释过程相同，故平行对照组EGFP阳性比例能间接反映OCT4的感染效率。对照组感染3 d后EGPF阳性率约为15%，说明OCT4-慢病毒的感染效率约为15%(图2)。用PCR技术检测到OCT4-慢病毒感染3 d的肝细胞，以OCT4质粒作阳参，未感染的原代肝细胞作阴参，可见感染3 d后外源OCT4已表达，表明病毒携带的OCT4基因已整合到肝细胞基因组内并开始转录。见图3。

图 1 分离8 h后的小鼠原代肝细胞(×200)(左)图 2 对照组感染3 d后EGFP的表达情况(×200)(中)图 3 PCR检测OCT4-慢病毒感染3 d后外源性OCT4的表达(右)Fig. 1 Mouse primary hepatocytes 8 hours after isolation(×200)(left)Fig. 2 EGFP expression in control group 3 days after infection(×200)(middle)Fig. 3 PCR showing exogenous OCT4 expression 3 days after OCT4-lentivirus infection(right)

3 病毒感染后肝细胞形态变化 我们观察了3 d、7 d、12 d、16 d的肝细胞形态，可见3 d时肝细胞逐渐变圆，细胞为单核或双核，病毒感染的细胞释放出包浆内颗粒，折光性略有增强(如图4)；7 d时肝细胞变为椭圆或类圆形，包浆内颗粒明显减少，细胞折光性增强，并出现了肝细胞的增殖(图4中箭头所指)，增殖的肝细胞为类圆形，体积较小，包浆颗粒较少，折光性较强(图4)；12 d时肝细胞增殖更为明显(图4)；16 d时细胞以增殖的肝细胞为主，原有的肝细胞明显减少(图4)，提示病毒感染和去分化过程可能刺激了肝细胞的增殖和分裂。对照组原代肝细胞在体外活性较难维持，故可见随着培养时间的延长，原代肝细胞数目减少，活性降低。到培养末期以成纤维及其他间质细胞为主。

图 4 实验组肝细胞感染OCT4-慢病毒后及对照组原代肝细胞的形态变化，箭头所示为新生肝细胞(×400)Fig. 4 Morphology of hepatocytes infected with OCT4-lentivirus in experimental group and primary hepatocytes in control group(arrowhead indicates the newly generated hepatocytes,×400)

4 肝细胞去分化过程中nestin的表达 在感染后的0~3 d中，成熟肝细胞标志物ALB表达下降，不成熟肝细胞的标志物AFP以及肝脏发育早期标志物FOXA2表达上升，表明肝细胞在OCT4作用下经历由成熟到不成熟的去分化过程，同时nestin表达从无到有、由弱变强；在第3~9天内，各基因表达较为恒定。从第12天起，各基因表达逐渐减弱，至18 d时已几近消失(图5、6)。可见，nestin 的表达从第3天持续至第12天，结合图3中的形态变化可见，在此期间肝细胞先丢失原有表型发生去分化，再出现肝细胞增殖。其中，从第3天到肝细胞出现增殖之前的第6天，高表达nestin并已去分化丢失原有表型的肝细胞可能具备了向神经、胰腺、肌肉等诱导的潜能。

图 5 PCR监测ALB、 AFP、 FOXA2、 nestin以及GAPDH在OCT4-慢病毒感染后3~18 d的表达Fig. 5 PCR showing expressions of ALB, AFP, FOXA2, nestin and GAPDH on days 3 -18 after OCT4-lentivirus infection

图 6 ALB、 AFP、 FOXA2 mRNA水平的变化趋势Fig. 6 ALB, AFP and FOXA2 mRNA expression levels

图 7 Nestin mRNA 水平的变化趋势Fig. 7 Nestin mRNA expression level

讨 论

随着糖尿病发病率逐年上升，β细胞的替代治疗正受到越来越多的关注。肝细胞已被证实可以转分化为IPC；去分化是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。我们认为，肝细胞先经去分化丢失自身表型，再向IPC诱导，有可能提高重编程的效率和最终得到功能完善的IPC。本实验结果可见，在OCT4-慢病毒感染的最初3 d内肝细胞已发生了去分化，而重编程另一个重要问题是诱导时机的选择。Wiese等[8]对胚胎干细胞(ESC)体外培养发现，在拟胚体(EBs)形成早期有大量nestin阳性细胞出现；在将ESC向神经、胰腺、肝脏及肌肉细胞诱导时均出现了nestin与各谱系前体细胞标志物短暂的共表达阶段，随着细胞进一步分化成熟nestin逐渐消失。Milanesi等[12]证实，骨髓来源的nestin阳性细胞可体外诱导为成簇的胰岛素分泌细胞及胰腺导管细胞。从胰腺分离得到的nestin阳性细胞可诱导为胰腺内分泌细胞，外分泌细胞及肝细胞[13]。据此可以认为，nestin是多谱系前体细胞的标志物，nestin的出现提示了细胞具有向神经、胰腺等谱系分化的潜能。因此我们通过监测nestin的表达来决定向IPC的诱导时机。本实验结果显示，原代肝细胞不表达nestin，而在去分化及增殖的过程中nestin表达增强，可见增殖出现前(3~6 d)高表达nestin的肝细胞可能已具备了向IPC诱导的潜能，此诱导时机为高效产生功能完善的IPC提供了重要的参考和依据。此外，Vaittinen等[14]和Shibuya等[15]证实，nestin在肌肉或神经损伤后的再生过程中表达增强。而且越来越多的证据表明，中间丝蛋白参与了一些主要生物学过程的调节如细胞分化、增殖以及细胞的自我保护等[16-19]。我们首次在OCT4-慢病毒介导肝细胞去分化过程中证实了nestin的上述表达规律。

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